1、2023年1月6日 博康www.zj- 1 细菌内毒素检查法干扰试验 讲 解 董光宴 湛江博康海洋生物有限公司 2023年1月6日 博康www.zj- 2 实验基本流程图实验基本流程图 供试品供试品 限值确定限值确定 最大有效稀释最大有效稀释倍数确定倍数确定 供试品干扰实验供试品干扰实验 正式实验正式实验 结果判断结果判断 2023年1月6日 博康www.zj- 3 供试品 新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。2023年1月6日 博康www.z
2、j- 4 供试品 在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。2023年1月6日 博康www.zj- 5 限值的确定 1、依据 2010年版中国药典附录“细菌内毒素检查用水”2010年版中国药典二部附录“化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则”2023年1月6日 博康www.zj- 6 干扰试验 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验
3、环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。2010版药典 2023年1月6日 博康www.zj- 7 干扰试验 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。2010版中国药品检验标准操作规范 2023年1月6日 博康www.zj- 8 干扰试验 干扰实验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供
4、试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。2010版中国药品检验标准操作规范 2023年1月6日 博康www.zj- 9 干扰试验 由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（如0.50或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。2010版中国药品检验标准操作规范 2023年1月6日 10 博康www.zj- 举例:1 试剂和样品 鲎试剂（生产单位：湛江博康海洋生物有限公司，灵敏度：0.25EU/ml）细菌内毒素检查用水 细
5、菌内毒素工作标准品（中检所提供）西咪替丁氯化钠注射液（【规格】50ml:西咪替丁0.2g与氯化钠0.45g P258）2023年1月6日 11 博康www.zj- 2 限值的确定 内毒素限值L=0.50EU/ml（2010年版中国药典二部正文258页）。2023年1月6日 12 博康www.zj- 3 干扰试验浓度的计算 按照中国药典2005年版提供的公式计算最大有效稀释倍数，计算方法如下：3.1 选用灵敏度为：0.25EU/ml时：MVD=CL/=10.5/0.25=2倍 3.2 选用灵敏度为：0.125EU/ml时：MVD=CL/=10.5/0.125=4倍 2023年1月6日 博康www
6、.zj- 13 4 预试验 4.1 目的 初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示）,为正式干扰试验提供依据。优点：减少摸索过程、节省成本 2023年1月6日 博康www.zj- 14 4.2 操作方法 由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰试验的预试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰试验造成的阳性影响。2023年1月6日 博康www.zj- 15 将供试品溶液进
7、行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/0.03 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）。另做2支阴性对照，和2支阳性对照。2023年1月6日 博康www.zj- 16 4.3 结果判断 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下可能无干扰，可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。2023年1月6日 博康www.zj- 17 样品信息 结 果 2倍 4倍 8倍 0.25EU/ml 0.25EU/ml
8、 0.25EU/ml PPC+样品管-PC+NC-4.4 结果记录 2023年1月6日 博康www.zj- 18 预试验结果，样品西咪替丁氯化钠注射液 在2-8倍稀释范围内不存在明显的增强和抑制作用，可选用其中任一浓度做该样品的细菌内毒素干扰试验。2023年1月6日 博康www.zj- 19 5 5 干扰试验溶液的制备 溶液 名称 WSE/被加入内 毒素的溶液 稀释 用液 倍 数 WSE 管数 供试品 无/供试品溶液 2 Et 2/供试品溶液 供试品溶液 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 4 4 4 4 ES 2/BET BET 1 2 4 8 2 1 0.5 0.25 4 4 4 4
9、 NC 无/BET 2 2023年1月6日 博康www.zj- 20 5.1 供试品溶液 样品西咪替丁氯化钠注射液 的稀释：用细菌内毒素检查用水将其稀释到2倍和4倍稀释液备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质的干扰。2023年1月6日 博康www.zj- 21 西咪替丁氯化钠注射液原液 2倍稀释液 4倍稀释液 2.0ml 2.0ml 0.5ml 0.5ml 图图 示示 2023年1月6日 博康www.zj- 22 5.2 鲎试剂灵敏度的对照系列 根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1ml溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成1.0EU/
10、ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml等6个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。2023年1月6日 博康www.zj- 23 150EU/ml 15EU/ml 2EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.125EU/ml 0.25EU/ml 0.06EU/ml 0.2ml 0.3ml 1.8ml 1.95ml 1.2ml 1.2ml 1.2ml 1.2ml 0.3ml 1.2ml 1.2ml 0.3ml 1.2ml 1.2ml 图图 示示 2023年1月6日 博康www.zj- 24 5.3 干
11、扰试验系列的制备方法、鲎试剂为0.25EU/ml样品浓度为2倍稀释的干扰试验系列溶液的制备：取西咪替丁氯化钠注射液 的原液0.6ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为1.0EU/ml）加入同一试管中，混合均匀即得到含内毒素为0.50EU/ml并同时含样品西咪替丁氯化钠注射液 的2倍稀释的混合液。2023年1月6日 博康www.zj- 25 然后用样品西咪替丁氯化钠注射液 的2倍稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀连同该混合液即可得到含内毒素分别为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml，含样品西咪替丁氯化钠注
12、射液 浓度为2倍稀释液的标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。2023年1月6日 博康www.zj- 26 样品 原液 内毒素1.0EU/ml 图图 示示 0.6ml 0.6ml 0.6ml 0.6ml 0.3ml 样品 2倍 0.3ml 0.6ml 0.6ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml 0.50EU/ml 2023年1月6日 博康www.zj- 27 、鲎试剂为0.125EU/ml样品浓度为4倍稀释的干扰试验系列溶液的制备：取西咪替丁氯化钠注射液 的的2倍稀释液 0.6ml加入试管中，然后吸取相同体积的内毒素标准溶液（浓度为0.5EU/ml）加入同一试管中，
13、混合均匀即得到含内毒素为0.25EU/ml并同时含样品西咪替丁氯化钠注射液 的4倍稀释的混合液。2023年1月6日 博康www.zj- 28 然后用样品西咪替丁氯化钠注射液 的4倍稀释液稀释该混合液，稀释倍数依次为2、4和8倍，将这三支管混合均匀连同该混合液即可得到含内毒素分别为0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml，含样品西咪替丁氯化钠注射液 浓度为4倍稀释液的标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。2023年1月6日 博康www.zj- 29 样品 2倍 内毒素0.5EU/ml 图图 示示 0.6ml 0.6ml 0.6ml 0.6ml 0.3ml 样
14、品 4倍 0.3ml 0.6ml 0.6ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml 0.03EU/ml 0.25EU/ml 2023年1月6日 博康www.zj- 30 6 干扰试验加样 WSE 对照名称 2 0.5 0.25 NC ES ET 2023年1月6日 博康www.zj- 31 7 干扰试验判断的标准 当Es在0.52.0(包括0.5和2.0)时，且 当 Et 在0.5Es2.0Es(包 括0.5Es 和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用。2023年1月6日 博康www.zj- 32 7.1 如所用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，供试品为XX注射液（稀释4倍）W
15、SE 对照名称 0.5 0.25 0.125 0.06 NC 结果 ES+-0.250.25 ET+-0.1250.125 Es在0.52.0，且Et在0.5Es2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)，认为供试品在该浓度下无干扰作用。2023年1月6日 博康www.zj- 33 7.2 如所用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，供试品为XX注射液（稀释4倍）WSE 对照名称 0.5 0.25 0.125 0.06 NC 结果 ES+-0.1250.125 ET+-0.420.42 虽 然 Es 在 0.52.0 范 围 内，Et 不 在0.5Es2.0Es 范围内，供试品在该浓度下有干扰作用，
16、需进行适当处理后重做试验。2023年1月6日 博康www.zj- 34 7.3 如所用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，供试品为XX注射液（稀释4倍）WSE 对照名称 0.5 0.25 0.125 0.06 NC 结果 ES+-0.100.10 ET+-0.250.25 Es不在0.52.0范围内，试验无效。2023年1月6日 博康www.zj- 35 7.4 结 论 依据中国药典2010版附录“细菌内毒素检查法”，西咪替丁氯化钠注射液细菌内毒素检查干扰试验2倍和4倍稀释液符合试验要求，对鲎试验没有干扰。2023年1月6日 博康www.zj- 36 7.5、检测浓度的选择 如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的第二个浓度作为日常检查的浓度。2023年1月6日 博康www.zj- 37 8 8 总总 结结 导致干扰的因素 pH值 抗凝因子 螯合剂 葡聚糖 .排除干扰的方法 稀释 中和 过滤 加热 2023年1月6日 博康www.zj- 38 谢 谢!
