1、中华 人民共和 国 国家标准G s/T 1 5 8 0 5.1 一 1 9 9 5淡水鱼类检疫方法第一部分T h e q u a r a n t i n e me t h o d s o f f r e s h w a t e r f i s h-P a r t1 主题内容与适用范围 本标准规定了淡水鱼类传染性胰坏死病(I P N)、传染性造血器官坏死病(I H N)、病毒性出血性败血症(V H S)、斑点叉尾鲍病毒病(C C V D)、鲤春病毒病(S V C),疖疮病、弧菌病和昏 眩病的检疫方法。本标准适用于口 岸进口 国外淡水鱼类的检疫，也适用于我国国内 地区间同种疾病的检疫。2 设备和器
2、械 检疫中所用设备和器械除根据各个学科有特殊要求外，均指鱼病实验室常用的设备和器械。3 传染 性胰 坏死病(I n f e c t i o u s P a n c r e a t i c N e c r o s is，简称I P N)该病病原属双链R N A病毒。本病流行于美洲、欧洲和亚洲。主要感染对象是鱼龄6 个月以内的虹缚、美洲红点蛙等蛙缚鱼类。6 个月以 上的鱼可以 是无症状的带病毒鱼，鱼卵也可携带病毒。3.1 临床检查3.1.1 活动情况 病鱼游动失调，常作垂直回 转游动，不久便沉人底部死亡。从开始回转游动到死亡的时间为1-2 h。在有水流的饲养池中可见失去游泳能力的鱼随水流贴在排水口
3、 的拦网 上。3.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，眼球突出，腹部膨胀。腹壁和鳍基部有出血现象。病鱼多从肛门排出线状粘液样粪便。3.1.3 剖检 除幽门 垂出 血外，肝脏和脾脏显著褪色，通常消化道内 无食物，胃 和肠前部积有乳白 色粘液而肿胀。3.2 实验室检验3.2.1 病毒分离3.2.1.1 细胞准备 a设备及器械 无菌室、超净工作台、恒温培养箱、低温冰箱(一3 0 0C)、液氮罐、赛氏 漏斗和。3,0.4 5 f m混合纤维素酷微孔滤膜、细胞培养瓶、白色橡皮塞等。b培养基及试剂 细胞生长液、胰酶-E D T A(乙 二胺四乙 酸)混合消化液、小牛血清,L 一 谷氨酞胺、碳酸氢钠、酒精。细胞
4、生长液等配制方法见附录A(补充件)。c.接种前的细胞准备国家技术监!局1 9 9 5 一 1 2 一 0 8 批准1 9 9 6 一 0 7 一 0 1 实施G B/T 1 5 8 0 5.1 一 1 9 9 5 传染性胰坏死病毒用C H S E-2 1 4,R T G-2 细胞分离。C H S E-2 1 4,R T G-2 最适培养温度分别为2 1,C和2 0 C。选择生长良好，形成单层的细胞培养物，倒去生长液加人适量胰酶-E D T A混合消化液消化，然后补加生长液，按1:2 或1:3 的分种率将原瓶消化的细胞分装入2 个或3 个培养瓶中，置适温中继续培养，当 单层致密度达8 0%左右，
5、即可用于病毒接种。3.2.1-2 样品接种 a.设备及器械 同3.2.1.1 条a 的规定，另增加冷冻离心机和1,2 m L规格的移液管。b常用的溶液 细胞维持液、磷酸缓冲盐水 配制方法见附录A(补充件)。c.取样 有症状的鱼，取1 0 尾以上样品作病毒分离用。无症状的鱼，取6 0 尾以上样品作病毒分离用。对鱼卵，取6 0 -1 0 0 粒样品作病毒分离用。对于少量进出口 成鱼，从尾动脉抽1-2 m L血液，其血浆作病毒分离用，血清作抗体检测。d.样品处理 较大的鱼取其肾、肝、脾。仔、稚鱼取鱼体全部，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊。鱼卵则取全卵。将上述待检样品称重，加磷酸缓冲盐水(P B S)匀
6、浆，并稀释成1 0-，离心3 0 m i n(4 0 0 0 r/m i n)，弃去沉淀物，将上清液通过。.4 5 W m微孔滤膜除菌，然后再用P B S进行 1 0 倍稀释，即成样品。血液样品置于常温下1 h 后，再放在4 下1 2 h 以上，以析出血清。然后低速离心，其沉淀作待检样品，按上述方法制备样品液，血清作中和试验。e.接种细胞 倒出细胞瓶中的培养液，然后接种样品液，接种量为维持液的1 0-,吸附1 h 后，加细胞维持液培养，同时设对照。3.2.1.3 病毒培养 传染性胰坏死病病毒(I P N V)培养温度是1 5-2 0 C。在培养过程中每日 观察细胞变化情况，观察7 d 结束。3
7、.2.1.4 结果观察 若接种样品含有病毒，培养2 -5 d 后，即出现明显的细胞致病变作用(C P E)，主要特征为细胞崩解，细胞单层破坏。收集阳性细胞悬液，冻融一次后，低速离心除去细胞碎片，上清液作病毒鉴定用。若接种后7 d 仍未见C P E,则判断为阴性结果。若7 d内出现可疑C P E现象，则需将该瓶细胞培养液作为接种材料再接种一次，以判断是否有CP Eo3.2.2 病毒鉴定3.2.2.1 中和试验 I(固定血清用量稀释病毒法)本试验用于鉴定在细胞培养中出现了C P E的样品是否为I P N V,3.2.2.1 门试验准备 。.细胞 R T G-2 细胞培养于9 6 孔微量细胞培养板上
8、。b.病毒用标准I P N V毒株，传代后制成病毒悬液。c.标准抗血清抗I P N V的标准血清，使用前于5 6 灭活6 0 m i n.d.待检样品(出现了C P E的细胞培养物)冻融一次，除去细胞碎片后使用。3.2.2 门.2 操作步骤3.2.2.1.2.1 将待检样品用H a n k，液作系列稀释，使其稀释度由1 0 二 到1 0-a，每管含量为。.5 m L.3.2.2-1.2.2 取两排试管 分别从上述各稀释度的待检样品中取出0.2 m l于两排试管中，然后第一G s/T 1 5 8 0 5 门 一 1 9 9 5.一-一一-一一 一叫 一一一一 一.一 一一-一 .排管加入 0.2
9、3.2.2.1.2.3m L 抗I P N V标准血清，第二排管加入。.2 m L 维持液，充分混合均匀。3 0 C 温育 6 0 mi n,3.2.2.1.2.4 温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满R T G-2 细胞单层的 9 6 孔微量细胞培养板，每个稀释度 4 孔，每孔0.1-L.3.2.2.1.2.5 将抗I P N V标准血清倍比稀释后(1:8 至1:6 4)接种于上述培养板，每个稀释度4 孔，每孔。0 5 mL，作为标准抗血清对照。将标准I P N V接种8 孔，每孔。.0 5 m L，作为病毒对照，其余8 孔作为正常细胞对照。3.2.2.1.2.6 各孔加入维持液
10、至总量 0.2 mL e3.2.2.1.2.了 放人 2 0 C 培养箱中培养，逐日 观察病变，记录结果(按表1 填写)。表 1 中和试验 I 结果记录表仪待检样品一 标准血清待检样品一 维持液标准血清I P N V对照细胞对照1 2 3 45 6 7 89 1 01 11 2A1 0，1:8P1 0-1C1 0-11:1 6D1 0 _ _ 4E1 0-51:3 2F1 0-cG1 0?1，6 4H1 0-a3.2-2.1.3 结果判定 按R e e d 和M u e n c h 法分别计算出待检样品 一 标准血清与待检样品一 维持液的细胞半数致死量(T C I D 5 o)，二者的滴度指数
11、之差的反对数即为中和指数。若正常细胞与标准血清对照为阴 性，标准毒对照为阳性，按表 2 判定结果。表 2中和指数结果判定 5 0阳性3.2-2.2 中和试验 I(固定病毒一 稀释血清法)本试验用于鉴定鱼血清中是否含有抗I P N V的中和抗体。3.2.2.2.1 试验准备 细胞 R T G-2 细胞培养于9 6 孔微量细胞培养板上。h.病 毒 标 准I P N V，使 用 前 用H a n k。液 稀 释 至5 0 T C I D 5 o/0.I m L,血清待检血清和正常血清(阴性血清)用等量的H a n k s 液(每毫升含青霉素2 0 0 I U,链霉素G s/T 1 5 8 0 5.1
12、 一 1 9 9 52 0 0 m g)稀释后，于4 5 灭活3 0 m i n，待冷却后使用。3.2.2.2.2 操作步骤3.2.2.2.2 门将已灭活处理的待检血清，用H a n k s 液作系列倍比稀释，使其稀释度由1:4 到 l:2 5 6,每管含量为。.2 m L,12.2.2.2.2 分别在上述各管中加入。.2 ml_(即为待检血清等量)的 5 0 T C I D,d0.1 m L的I P N V悬液，充分摇匀混合12.2.2.2.3 于 3 0 C温育 6 0 mi n a12.2.2.2.4 取出后分别接种于长满R T G-2 细胞单层的9 6 孔微量细胞培养板，每个稀释度 4
13、 孔，每孔0.1 m l12.2.2.2.5 按上述步骤设立正常血清对照;将标准I P N V悬液连续1 0 倍稀释后(1 0-1 0-)接种上述培养板，每稀释度 4 孔，每孔。.1 m L，作病毒悬液毒力滴度对照;9 6 孔微量细胞培养板H排 1 2 孔作为正常细胞对照。12.2.2.2.6 各孔加人细胞维持液至总量0.2 m L,3.2.2.2.2.了 放入2 0 培养箱培养，逐日 观察病变，记录结果(按表 3 填写)。表 3 中和试验 I 结果记录表仪待检血清正常血清对照病毒滴度对照1 2 3 45 6 7 891 01 11 2A1:4B1:81 0-C1:1 61 0-1D1，321
14、 0-3E1:6 41 0 F1:1 2 81 0-G1:2 5 61 0-sH细胞对照1 0?3.22.2.3 结果判定根据病变用R e e d-Mu e n c h法或K a r b e r 法计算出血清中抗体效价(即能保护 5 0%的细胞培养孔不产生病变的最高血清稀释度)。血清中和抗体效价大于或等于1!1 6 者为阳性，小于1:1 6 者为阴性。3.3 综合判定 若出现上述临床症状，经细胞培养又出现C P E，并经中和试验为阳性者可判定患有传染性胰坏死病。b.若无临床症状，但经细胞培养出现C P E，并经中和试验为阳性者判定为I P N V携带者。若中和试验为可疑，则判定为可疑。d 若
15、无 临 床 症 状，经 细 胞 培养 也 不出 现C P E,但鱼 血 清中 抗I P N V中 和 抗 体为 阳 性者，则 判 定 在近期内患过传染性胰坏死病。若仅有临床症状，或仅能在细胞培养中出现C P E，但不能被抗I P N中和抗体中和者则不能称患有 I P N，需进一步作其他病检查。G s/T 1 5 8 0 5.1 一1 9 9 54 传染性造 血器官 坏死病(I n f e c t io u s H e m a t o p o ie t ic N e u r o s is，简称I H N)该病病原属弹状病毒。本病流行于美国、加拿大和日 本。主要危害虹蹲、红点马苏大马哈鱼等蛙蹲鱼类
16、的稚鱼，一龄鱼亦有感染的情况。水温1 5 以上鱼呈无症状带毒状态，鱼卵也可带毒。4.1 临床检查4.1.1 活动情况 病鱼最初游动迟缓，无力地随水漂浮着，接着顺水流摇晃地游着，虽有痉挛似地动作，但不久就上浮，横着身子而且时常急剧地游泳，不久就死亡。这期间所见狂奔动作为本病的一个特征。4.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，肛门通常拖着一条半透明的粪便，亦是该病的一个特征。腹部有腹水且肿胀，眼球突出。贫血.鳃显著褪色。从胸鳍基部、背鳍一直到前部，以及肛门附近的躯干肌肉常有出血现象，口 腔壁亦有出血点。具有卵黄的仔鱼卵黄囊出血，内充满浆液而肿胀。4.1.3 剖检 脾、肾坏死，脾脏和幽门垂四周的脂肪组织、腹膜、脑和围心膜等处常有出血点，肠道也有出血现象。4.2 实验室检验4.2.1 病毒分离4.2.1.1 细胞准备 同3.2.1.1 条，不同的是传染性造血器官坏死病病毒(I H N V)除可用C H S E-2 1 4 细胞分离外，最适分离病毒细胞是F H M，培养温度2 8 0C,4.2 门.2 样品接种 同3.2.1.2 条。4.2.1.3 病毒培养 I H N V培养温度是1 5 C，在培
