1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 6 4.1-2 0 0 2牛传染性鼻气管炎病毒分离操作规程Pr o t o c o l o f v i r u s i s o l a t i o n f o r i n f e c t i o u s b o v i n e r h i n o t r a c h e i t i s2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 03 一 0 5 一 01实施中华人民共和国国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 6 4.1-2 0 0 2前言 本标准的试验方法是参考国际兽疫局 诊断试验和疫苗标准手册
2、 介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:苏卫、张晓丁、王涛、李凌枫。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 6 4.1-2 0 0 2牛传染性鼻气管炎病毒分离操作规程1 范围 本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒分离方法。本标准适用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用
3、于本标准.然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分 析实验室用水规格和试 验方法(n e q I S O 3 6 9 6:1 9 8 7)缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1T CI D S o半数组织培养感染量。3.2I B R牛传染性鼻气管炎。3.3M D BK牛 肾传代 细胞系。4原理 牛传染性鼻气管炎(I B R)是牛的急性传染性疾病。患牛康复后仍可长期带毒。感染 I B R病毒的公牛，精液中可能含有病毒。通过对采集病料的检测，以确定是否带有病毒。5 试剂和材料5.1
4、 标准阳性血清，阴性血清，由指定单位提供。5.2 培养液:配制见附录A,5-3 细胞分散液:见附录A,5.4 1 0 0 刃,5 0 0 川 微量可调移液器，无菌塑 料滴头。5.5 无菌6 孔、2 4 孔细胞培养板。5.6 无菌棉拭子:5 mL-1 0 mL无菌玻璃试管。5.7 本标准所用水应符合GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2中一级水的规格。5.8 样 品5.8.1 呼吸道样品:用灭菌棉拭子伸人鼻道采取分泌物，放人含青霉素 1 0 0 0 I U/ml,链霉素1 0 0 0 p g/m L,p H 7.2 的E a r l e s 液瓶中。也可用棉拭子采集眼分泌物放人E a r l
5、e 液中。5.8.2 阴道样 品:用棉 拭子采取脓疙 性外 阴阴道 炎早期病 变时的阴道粘液，放人 含青霉素1 0 0 0 I U/m l，链霉素1 0 0 0 p g/m I _,p H 7.2 E a r l e 液的瓶中。S N/T 1 1 6 4.1-2 0 0 25.日.3 脑组织样品:在剖检时无菌采集脑组织样品。5.8.4 流产胎儿组织样品:刚死亡的胎儿，立即无菌采集肺、肾、脾等各种组织样品，放人含青霉素1 0 0 0 I U/m L，链霉 素 1 0 0 0 F g/m L,p H 7.2 E a r le 液的 瓶中，或吸取胸水.5.8.5 血清样品:常规无菌采血分离血清。5.
6、8.6 精液样品:采集新鲜精液或抽取冷冻精液管。6器械和设 备6.1 冰箱、冰柜。6.2 二氧化碳培养箱。6.3 离心机。6.4 超声波裂解器。6.5 倒置显微镜。6.6 0.4 5 F p m滤器。7 试验方法7.1 样品运输 采集的样品应立即放人4 冰箱保存，在 2 4 h内送到实验室。7.2样品处理7.2.1 收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动、拧干棉拭子，样品经 1 0 0 0 0 r/mi n离心1 0 mi n,取上清液作为组织培养的接种材料。7.2.2 组织 样品:先用E a r l e 液(p H 7.0)制成2 0%的匀浆悬浮液，经1 0 0 0 0 r/m i n
7、离 心1 0 m in，取上清液作为组织培养的接种材料。7.2.3 胸水:每毫升加1 0 0 0 l u 青霉素,1 0 0 0 F i g 链霉素，1 0 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n 取一清液。7.2.4 精液:将精液作 1，5 -1，2 0稀释，反复冻融 3次4次或用超声波处理，1 0 0 0 0 r/mi n 离心1 0 m i n.取上清液备用。7.2.5 上述样品 制备后可 加人 适量两性 霉素或经0.4 5 1,m 滤器过滤。7.3 细胞制备 使用三代以内的胎牛肾细胞(B K),辜丸细胞(B T)，细胞浓度约为3 X1 0 /mL,B K或 B T细胞的制备
8、:无菌采取初生犊牛肾或肇丸，磨碎或剪碎，再用细胞分散液消化制备细胞，加细胞培养液置 3 7 C二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。使用 MD B K传代细胞，按常规方法培养，长成良好单层备用。7.4 试验程序7.4.1 取经过处理的样品0.1 m L接种到已形成 良好单层的牛肾或辜丸或 MD B K细胞培养板上，每份样品接种四孔。7.4.2 置3 7 吸附 1 h，加人含3%犊牛血清(不含I B R抗体)的细胞维持液 1 mL。置3 7 0C 5%二氧化碳培养箱培养，逐日观察细胞病变 5 d,7.4.3 每日观察细胞病变(C P E)情况，详细记录。7.4.4 培养 5d 仍不出现细胞病变，则收
9、取培养物盲传三代继续培养观察。出现病变者收取培养物，保存于一7 0 C以下待鉴定。75 结果判定 本病毒致细胞病变特点是细胞变圆、聚合、呈葡萄状、拉网、最后脱落。取出现上述病变的细胞培养物.经冻融裂解两次后，以 1 0 0 0 0 r/mi n 离心 1 0 mi n，取上清液再做下列试验。7.5.1 丁 C I D,的测定:按Re e d-Mu e n c h氏方法测定计算分离物 T C I D。的终点。7.5.2 分离物作病毒中和试验:用 I B R标准阳性血清(效价 1，3 2以上)和阴性血清分别与该分离物作中和试 验(固定血清，稀释病毒)按R e e d.M u e n c h 法计算
10、T C I D 5o,7.5.3 如分离物能引起典型的 I B R细胞病变，并经病毒中和试验(固定血清，稀释病毒)，其阴性血清组和阳性血清组的 T C I D 5。的对数之差大于等于 2.5，则判该分离物为 I B R病毒。或使用 P C R,E L I S A等方法进行鉴定。S N/T 1 1 6 4.1-2 0 0 2 附录A (规范 性附录)溶液配制A.1 培养液 1 9 9 培养基(或 ME M培养基)，加人含 1 0%无病毒抗体胎牛血清，抽滤除菌，加青霉素 2 0 0 I U/mL,链霉素2 0 0 F e g/m L,A.2 维持液 1 9 9 培养基(或 ME M培养基)，加人含
11、 2%无病毒抗体胎牛血清，抽滤除菌，加青霉素 2 0 0 I U/ml，链霉素2 0 0 p g/m L.A.3 细胞分散液 胰蛋白酶2.5 0 g 乙二胺四乙酸二钠(E D T A)0.2 0 g 无钙镁 P B S 1 0 0 0 mL 混匀抽滤除菌。A.4 Ea r l e液 (1)原液甲抓化钠(N a C D 6 8.0 g 抓化钾(K C U 4.0 g 磷酸二氢钠(N a H,P 0,H,0)1.4 g 葡萄糖1 0.0 g 将以上各成分溶解于水中，加水至 5 0 0 mL。加三抓甲烷 1 m L防腐，置 0 C -4 冰箱内备用。(2)原液乙氯化钠(N a C D 2.0 g 抓
12、化镁(Mg C L,6 H 2 0)1.7 g 0.4%酚红液5 0 ml,将以上各成分溶解于水中，加水至 5 0 0 mL。加三氯甲烷 1 m L防腐，置 0 C -4 冰箱内备用。按下述比例配成E a r l e 氏液 原液甲1份 原液乙1 份 一级水1 8份 6 8.9 4 k P a 1 5 m i n灭菌后，置 0 C 4 冰箱内备用。使用时加 7.5%碳酸氢钠(N a H C O,)液调p H7.2 .7.6,A.5 无钙镁 P B S 氯化钠(Na C U 8.0 g 抓化钾(K C D 0.2 g 磷酸氢二钠(Na z HP 认)1.1 5 g 磷酸二氢钾(K H 2 P 0 4)0.2 g 一级水1 0 0 0 m L 将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌(6 8.9 4 k P a 1 5 m i n)或抽滤除菌备用。
