1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 6 9-2 0 0 2猴沙门氏菌检验操作规程P r o t o c o l o f e x a mi n a t i o n f o r s a l mo n e l l a i n mo n k e y s2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 0 0 3 一 0 5 一 01 实 施中华人民共和匡国家 质 量 监督 检 验 检 疫 总 媛S N/T 1 1 6 9-2 0 0 2.J J 旧.J 目 q吕本标准的实验方法是在参考国内、国外实验室的检验规程和总结了多年的实践制定的。本标准的附录 A,附录 B为规范性附录，附录
2、C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:董俊、肖荣海、徐维加、周晓黎、赵颜润。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 6 9-2 0 0 2猴沙门氏菌检验操作规程范围本标准规定了猴沙门氏菌的检验方法。本标准适用于猴沙门氏菌的检验。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件，其最新版
3、本适用于本标准。G B 4 7 8 4.4-1 9 9 4 食品微生物学检验 沙门氏 菌检验 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析 实验 室用7 尺 规格 和试酚方9#.设备和器材3.1 温箱。3.2 天平。3.3 显微镜。3.4 无菌棉拭子。3.5 接种环。3.6 载玻片。3.7 试管。3.B 三角烧瓶。3.9 试管架。3.1 0 酒精灯。3.1 1 平皿。4 培养甚和试剂4.1 G N肉汤:按 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中4.1 7 规定。4.2 L S C肉汤:按G B 4
4、 7 8 9.2 8-1 9 9 4中4.1 6 规定。4.3 甘油缓冲液:见附录A,4.4 H a j n a 样品保存液:见附录 Ao4.5 S S琼脂培养基:按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中4.2 2 规定。4.6 DH L琼脂培养基:按 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中4.2 0 规定。4.7 亚硫酸秘(B S)琼脂培养基:按G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 中4.1 9 规定。4.8 HE琼脂培养基:按 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中4.2 1规定。4.9 三糖铁(TS D琼脂培养基:按 G B 4 7 8 9.2 8
5、-1 9 9 4中4.2 6规定。4.1 0 糖发酵培养基:按 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中 3.2规定.S N/T 1 1 6 9-2 0 0 24.1 1 氧化酶试剂:按GB 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中3.1 8规定。4.1 2 革兰氏染色法:按 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4中2.2 规定。4.1 3 沙门氏菌诊断血清:由指定单位提供。5检疫程序见 附录 Be6操作步骤6，1 采样、运输和保存6.1.1 将灭菌棉拭子用增菌液或生理盐水湿润后直肠采样或采取新鲜粪便，放人 G N肉汤和棉拭子直接涂布于选择性平板培养基上。6.1.2 样品采集后
6、需延迟送检的，可保存于甘油缓冲液或 H a j n a 样品保存液中，保存时间不超过7 2 h,6.2 增菌培养 将 GN肉汤3 6 士1 0C 4h-8h培养后，取 工mL上液加人 9 ML S C增菌液中 3 6 士I C培养1 8 h-2 4 h,6.3 选择性分离 用 S S琼脂和 D HL,B S,HE,WS琼脂中任选一种，对上述选择性增菌肉汤液进行划线分离或直接用肛门棉拭子划线分离。于 3 6 士1 培养 1 8 h-2 4 h。观察各个平板上的菌落形态。沙门氏菌各亚种的菌落形态见表 1,表 1 沙门氏菌在不同选择性平板上的菌落特征选择性琼脂平板亚属 工、ll.1VI V亚属川(即
7、亚利桑那菌)S S琼 脂无色半透明;产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色。但不如其他培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属I、II、I V.V相同乳搪阳性的菌株为粉红色，中心带黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区别D HI.琼 脂无色半透明;产硫化氢茵落中心带黑色或几乎 全 黑 色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属1,Q.I V,V相同乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带 黑 色HE 琼 脂WS琼 脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色;乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色中心黑色或几乎全黑色B S琼 脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、
8、棕揭色或灰色。菌落周围培养荃可呈黑色或棕色 有些菌株不产硫化氢，形成灰绿色的菌落 周围培养基不变黑色有金属光泽64生化试验6.4.1 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁斜面 琼脂培养基，一般应挑4 个一 5 个菌落，以防漏检。3 6 士1 培养 1 8 h-2 4 h o6.4.2 观察三糖铁琼脂培养基的反应，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2,zS N/T 1 1 6 9-2 0 0 2表 2 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜 面底 层产气硫 化 氢可 能 的 菌 属 和 种 +/一+沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌+十十/一+沙门氏菌皿、弗劳地氏柠檬
9、酸杆菌、普通变形杆菌+伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌 蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属+沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌 属+/一大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸 杆 菌注:+阳性;一阴性;+/一多数阳性，少数阴性。6.4.3 在三糖铁斜面培养基有斜面产酸并同时硫化氢阴性和底层不产酸的菌株可以判沙门氏菌阴性，其他的反应结果做氧化酶试验，氧化酶阳性的培养物，报告为沙门氏菌阴性;氧化酶阴性和革兰氏染色阴性的培养物进一步进行生化鉴定。6.4.4 接种蛋白脉水(供靛基质试验),p H 7.2尿素琼脂、氰化钾培养基
10、和赖氨酸脱梭酶培养基及对照培养基各一管，于 3 6 0C士1 培养1 8 h-2 4 h，必要时可延长至 4 8 h，按表3判定结果。按反应号分类，沙门氏菌属的结果应属于 1,2,5，其他反应结果报告为抄门氏菌阴性。表 3肠杆菌科各属 生化反应初步鉴别表序 号硫 化 氢靛基质尿 素氰 化 钾赖 氨 酸判 定 菌 属1+十沙门氏菌属2+沙门氏菌属、缓慢爱德华氏菌3+弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌4+普通变形杆菌5+沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副寒沙门氏菌、志贺氏菌属6+十+大肠埃希氏菌、志贺氏菌属7斗)+克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸 杆 菌8+/一+摩根氏摩根氏菌、普罗菲登斯菌
11、属注:+阳性;一阴性;+/一多妇 阳性，少数阴性。6.4.4.1 反应号1:典型反应判沙门氏菌属阳性。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱梭酶三项中有一项异常，按表4可判为沙门氏菌。如有二项异常，则按反应号 3 判为弗劳地氏柠檬酸杆菌 表 4p H 7.2尿家氰化钾赖氨酸判定结果甲型副寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)一 十+沙门氏菌 P 或V(要求符合本群生化特性)+沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)注:+阳性;一阴租S N/T 1 1 6 9-2 0 0 26.4.4.2 反 应号2:补 做甘露醇和山梨醇试验，按表5 判 定结果。6.4.4.3 反应号5:补 做O N P G,O N P G阳性为大
12、肠埃希氏菌,O N P G阴性为沙门氏菌。同 时沙门氏菌应为赖氨酸阳性，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸阴性。表 5甘 露 醇山 梨 醉判定结果+沙门氏菌靛基质阳性变体(要求血清学鉴定结果)缓慢爱德华氏菌注:+阳性;一阴性.6.4.5 必要时按表6进行沙门氏菌生化群鉴别。表 6 沙门氏菌生化鉴别表项目IUmNvU卫 矛 醇+十山梨醇+十+水 杨 酸+O NPG+项目 III田Nv叨丙 二 酸 盐+氰 化 钾+注:十阳性;一阴性6.5 血清学分型鉴定6.5,1 抗原的准备 一般采用 1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。6.5.1.1 O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如 2.5%
13、-3%)培养基上再检查;如果是 由于v i 抗原的存在而阻止了0抗原凝集反应时，可挑取菌苔于 I ml，生理盐水中做成浓菌液，在酒精灯火焰上煮沸后在检查。二6.5.1.2 H抗原发育不良 时，将菌株接种在。7%一。8%半固 体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查;或 将菌 株通过装有。.3%-0.4%半固 体琼脂的小玻管 1 次一2 次，自 远端取菌培养后在检查。6.5.2 O抗原的鉴定 用A-F 多价血清做玻片凝集试 验，同 时用生理盐水做对照。在生理盐水中自 凝者为粗糙菌株，不能分型。6.5-2.1 被A-F多价血清凝集者，依次用 O 0 0,0;0 7,0 8,0 9,
14、0:和 O,因子血清做凝集试验。根 据试验结果，判定O群。被0 q。血清凝集的菌株，再用。1 0 1 0 15 1 0 3 4,0 1，单因 子血清做凝集试验，判定E 瓦,E,E;各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均根据0单因子血清的 检查结 果，没有O单因子血清的要用两个 O复合因子血清进行核对。6.5.2,2 不扯A-F多价 O血清凝集者，先用沙门氏菌因子血清中的9种多价血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这 种血清所包括的O血清逐一检查，以确定 O群。每种多价O血清所包括的因子如下:O多价 1 A,B,C,D,E,F群(并包括 6,1 4 群)O多价 1 A,B,C,D,E,F群(并包括
15、 6,1 4 群)s x/T 1 1 6 9-2 0 0 2 O多价 2 1 3,1 6,1 7,1 8,2 1 群 O多价 3 2 8,3 0,3 5,3 8,3 9群 O多价 4 4 0,4 1,4 2,4 3 群 O多价 5 4 4,4 5,4 7,4 8 群 O多价 6 5 0,5 1,5 2,5 3 群 O多价 7 5 5,5 6,5 7,5 8 群 O多价 8 5 9,6 0,6 1,6 2 群 O多价9 6 3,6 5,6 6,6 7 群6.5.3 H抗原的鉴定6.5.3.1 属于A-F各 O群的常见菌型，依次用表7 所述 H因子血清检查第 1 相和第2 相的 H抗原。表 7 A
16、-F常见菌型的H抗原表(群第 1 相第 2相AA无B9,(,s无B3i,b,d2C 1k,v,r,c5,.sC2b,d,r2,5D(不产气的)D无D(产气的)g,m,P,9无0 群第 1 相第2相Elh,v6,w.xE49，s，t无E4I e2 已6.5.3.2 不常见的菌型，先用沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种 H因子血清逐一检查，以确定第 1 相和第 2相的抗原。8种多价血清所包括的 H因子如下:H多价 1 a,b,c,d,i H多价 2 e h,e n x,e n z l s,f g,g m s,g p u,g p,mt,g z s,H多价 3 k,I,y,z,z l o,l v,l w,1 Z 1 3,1 z,a,l z 4 6 H多价 4 1,2;1,5;1,6;1,7;2 6 H多价 5 Z 4 Z 2 3,Z 4 Z 2 4,Z 4 Z 3 2,Z 2 9,Z 3 5,Z 3 6,Z 3 6 H多价 6 Z 3 9,Z 4 1,Z 4 2,2 4 4 H多价 7 z 5 2,z,z,z 5,H多价 8
