1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4马传染性贫血补体结合试验方法P r o t o c o l o f c o m p l e m e n t f i x a t i o n t e s t f o r e q u i n e i n f e c t i o u s a n a e m i a2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 MS N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4o li吕本标准的附录 A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认
2、可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人:王浩、柳炳兰、巫剑平、曲贵威。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4马 传 染 性 贫血 补体 结 合试 验 方 法范围本标准规定了马传染性贫血补体结合试验方法。本标准适用于马传染性贫血抗体水平的检测。2仪器设备2.1 培养箱。2.2 冰箱。2.3 恒温水浴箱。2.4 离心机，离心管。2.5 天平(感量 0.1 g),2.6 平皿:规格 9 0 mmx1 5 mm,2.7三角烧 瓶(5 0 mL-2 5 0 mL),2.8 试管、试管架:规格 1
3、2 X 3 7 m m,1 0 X1 0 0 mm,2.9 吸管:规格 1 m L,5 mL,1 0 mL,2.1 0 2 0 0 p L可调微量移液器和吸头。3材料3.1 试剂:氯化钠、氯化钙、氯化镁、葡萄搪、拘椽酸钠、巴比妥钠、巴比妥、明胶均为分析纯3.2 溶液的配制:见附录 A3.3 抗原:检测用标准抗原应用同一批号的两种抗原，即V抗原(接毒抗原),C抗原(对照抗原)。3.4 标准阳性血清及阴性血清:由出售抗原的药厂同时提供。3.5 被检血清:参见附录B,3.6 补体:参见附录B,3.7 溶血素 由生物药品厂购人，保存于冰箱中备用(由于溶血素加有等量甘油防腐，故使用时应将甘油扣除，即 2
4、 mL中溶血素的实量为 1 mL),3 8红细&A 参 n附录 B预备试验4.1 补体效价测定 将新鲜 补体或冻干补体，按表比例稀释成一系列不同浓度待用。表 1补体 稀释法单 位 为 毫 升17G 1234567891 01 1 补 体G V B 液B Y:丫 3 Y:丫 3 Y 7 -,Y3 7Y3:丫7-,:S N/T1 3 5 8.1 一2 0 0 4按表 2 进行测定选出该批抗原补体效价和使用的管号，继续使用该批抗原补体时可不再测定.表 2补体测定表单位为毫升誉 契 鬓1234口67891 0111:1 稀释的马血清 C抗 原各种稀释度补体0 0 50 0 50 10，0 50，0 5
5、0.10 0 50 0 5O t l0，0 50.0 50.10.0 50 0 50.10，0 50.0 50.10.0 50 0 50.10，0 50.0 50 10.0 50.0 50.10 0 50.0 50.10.0 50 0 50 1置普通冰箱(4)过夜(1 6h 1 8h)4%致敬红细胞0.10 l0.10.10 10.10.10.10 10 10.1置 3 7 38水浴箱 30 m i n，待红细胞沉淀后判定结 果全 溶全 溶全 溶全 溶全溶全溶全 溶部 溶部 溶部 溶部 溶 从表 2 中可以看出，第一管至第七管皆呈显完全溶血，则该批补体效价为第七管的稀释度。在补体用于受检血清时
6、应选择第五管至第十一管，即用 C抗原列有三个管完全溶血的七个稀释浓度。但在阳性血清对照组中需用第三至第十一管。4.2 溶血素效价测定 每批溶血素在使用前需测定效价一次，并标明其效价，继续使用可不再测定。按表3将溶血素稀释;先将溶血素稀释 1 00倍，即0.Z mL溶血素加人 9.sm L G V B溶液。按表4 测定溶血素效价。表 3溶血素稀释 法单位为毫升 访迎 塑 缪10 0 02 0 0 03 0 0 04 0 0 050 0 060 0 070 0 08 0 0 09 0 0 0 G V B液10Q倍溶血素1。倍溶血素一112l314151 61，719l表 4 溶血素效价测定单 位
7、为 毫 升次10 0 02 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 060 0 0700 08 0 0 09 0 0 0 溶 血 素1，4 0 倍补体 GV B液4%红细胞液0.0 50 10 l0.0 5一0.0 50.10，10，050.050.10 l0.0 50.050 l0.10 0 50.0 50.10.10 0 50 050 10.10.050 0 5O 10.10 0 50.050.10.10 0 50.0 50.10 10 0 5置37水浴箱 10mn结 果全 溶全 溶全溶全 溶全溶部 分 溶部 分 溶部 分溶不 溶 发生全部溶血的最大稀释倍数为该批溶血素的一个单位
8、。表 4中从 1 0 00 倍50 00 倍各管都呈现完全溶血，而以50 00 倍管中所含溶血素量最少，因此，该试验溶血素效价为 1，5o 00 倍。在正式试验时，溶血素按两个单位稀释使用。如效价为 1，50 00 倍，则溶血素稀释成 25 00 倍使用，5正式试验5.1 取若干列试管，每列七管，每两列为一组，按表 5排列.S N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4表 5 马传贫补反操作方 法(示例)单 位 为 毫 升5.1.飞 加被检血清 在每支试管中加人被检血清0.0 5 mL。而阳性血清对照组加 0.0 5 mL阳性血清;抗原对照组每管加 G V B液 0.0 5 mL.5.1.2
9、加抗 原 各组的第一列每管加人 V抗原0.0 5 mL。各组的第二列每管加人 C抗原。.0 5 mL.5.1.3 加朴体 将被检血清试管号与各种稀释度的补体试管号对好，取第1 1 管补体加人被检血清(两列)的第七管中，取第 1 0管补体加入被检血清第六管中，如此推至第一管，每管加0.1 mL.5.2 上述三种成分加完后，振荡均匀放人普通冰箱过夜(1 6 h-1 8 h),53 加致敏红细胞:第二天从冰箱取出试验管在室温中放置，同时配制致敏红细胞(4%绵羊红细胞和2 单位溶血素的 等量混合液)，将此混合液于室温放置3 0 m i n，再置于3 7 水浴中1 0 m i n-2 0 m in a
10、随后每管加人致敏红细胞液0.1 mL,振荡均匀后，放入3 7 水浴箱中感作 3 0 mi n。取出置于室温中，待剩余的红细胞完全沉淀后(约 2 h -3 h)进行判定。6结果判定 结果的判定是用 0,0.1,0.2.0.9 及 1.0等数字分别表示为完全溶血;1 0%不溶血;2 0%不溶血;.9 0%不溶血及 1 0 0%不溶血。将 V抗原列各管判定数之和减去C抗原列各管判定数之和，其差数为被检血清的抗体价。每次试验必须设立对照系统 抗原对照和标准阳性血清对照)。当抗原对照为 0，而标准阳性血清对照效价为 5.0以上时试验成立，否则无效。被检血清效价在。.8及以上者为阳性;0.2 及以下者定为
11、 3S N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4阴性;0.3-0.7 者须重复试验，出现。.3 及以上者定为阳性;0.2 及以下者再复试一次，仍为 0.2 及以下者定为阴性，出现0.3 及以上者为阳性(见表 6).表 6 结果判定示例马号抗原1234567差数判定1 0VU0.20.5:.:;.;:.:1.8+1 5VC0.1:.:.;:.:，:0.5复试2 0VC:.:.:0.80.8:.:0S N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4 附录A (规范性 附录)试荆配制A.1 GV B液A.1.1 V B液(巴比妥缓冲液)巴比妥钠3.7 5 g 巴比妥5.7 5 g 抓化钠8 5 g 先
12、将抓化钠和巴比妥钠溶于2 0 0 0 mL无离子水中，巴比妥溶于5 0 0 mL热无离子水中，然后缓慢混合，冷却后加无离子水至2 0 0 0 m L.A.1.2 0.0 3 m o l/L板化钙溶液 一无水抓化钙(分子量=1 1 0.9 9)0.3 3 g 无离子水加至 1 0 0 mLA.1.3 0.1 mo l/L抓化镁溶液 抓化镁(分子量=2 0 3.3 3)0.9 5 g 无离子水加至 1 0 0 mL 抓化镁需经 1 0 0 左右烘一昼夜除去其中水分后称量。A.1.4 2%明胶液 明胶1 0 g 无离子水5 0 0 mL 加热溶解后，用滤纸滤过，6 8.9 5 k P a 1 0 m
13、 i n灭菌，保存于 0 0 C -4 冰箱内备用。A.1.5补反使用液(GV B液)VB液2 0 0 mL 0.1 mo l/L氯化镁溶液5 mL 0.0 3 mo l/L氯化钙溶液5 mL 2%明胶液5 0 mL 无离子水加至 1 0 0 0 mLA.2阿氏液 葡萄糖2 4.6 g 拘椽酸钠9.6 9 氯化钠5.0 4 g 无离子水加至 1 2 0 0 mL 用 5%拘椽酸液，将 p H调至 6.1。分装成六瓶，6 8.9 5 k P a压力灭菌 1 0 mi n，放。C 4 冰箱保存。S N/T 1 3 5 8.1-2 0 0 4 附录B (资料性附录)预备试验B.1 血清稀释 按照常规
14、方法无菌采血并分离血清,4 冷藏保存。使用时，用 G V B液按 1，1 稀释，置恒温水浴5 8 灭能3 0 m i n,驴、骡血清6 2 灭能3 0 m i n。标准阳性血清及阴性血清使用时，用补反使用液(G V B)进行 1，1 稀释，5 8 灭能3 0 m i n,B.2 李 卜 体制备 取五只以上健康豚鼠，停早饲，每只采血 8 mL-1 5 m L(亦可取全血致死)，注入培养皿内，放于3 7 0C温箱内3 0 min，取出置4 冰箱内，待血清析出后，吸人离心管中，以 3 0 0 0 r/mi n离心 1 5 min-2 0 m i n，取上清稀释应用，也可用冻干补体。1 3.3 4%红细胞液的制备 取盛有阿氏液(见附录A第 A.2 章)2 0 0 mL的灭菌瓶一个，由公绵羊颈静脉无菌采血 1 0 0 M L,混匀后放普通冰箱保存。使用时将血液倒人离心管中，经3 0 0 0 r/mi n 离心 1 0 m i n，弃去上清液和白细胞薄膜，将沉淀的红细胞泥加 G V B液混合均匀，再次同上离心，弃去上清液，如此反复洗涤四次后，配制成4%红细胞液(4 m L红细胞泥加 9 6 mL GV B).
