1、NY/T684-20034.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，3730min。4.2.4PBS漂洗三次，每次5min。4.2.5将室玻片放入底物溶液中，室温下显色5min10min。PBS漂洗两次，再用蒸馏水漂洗一次。4.2.6吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。4.3结果判定4.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下：即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色：阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果：否则应重试。4.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为CDV抗体阴性。4,3.3待检血清与正常细胞反应呈无色，而
2、与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判为CD抗体阳性。5免疫酶组织化学法5.1材料准备5.1.1试剂a)磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章b)标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1：1024。c)标准阴性血清：无CDV感染的犬血清。d)酶结合物：HRP标记的SPA。c)过氧化氢甲醇溶液：配制见第A.4章。f)盐酸酒精溶液：配制见第A.5章。g)胰蛋白酶溶液：配制见第A.6章。h)底物溶液：配制见第A.3章。5.1.2器材a)普通光学显微镜；b)微量加样器，容量50l200【.:c)石蜡切片机或冷冻切片机；d)载玻片及盖玻片：e)37恒温培养箱或水浴箱。5.1.3样品对疑似CD
3、V的病死犬或扑杀犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中定，保存，送检。5.2操作方法5.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10min15min:新三护或固定组织按常规方法制备石蜡切片，常规脱蜡至PBS(切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂以兰：5.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37作用20mi。5.2.3胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2min,以便充分暴露抗原5.2.4漂洗：PBS漂洗三次，每次5min。5.2.5封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1：10稀释的正常马血清，37（湿盒中写30min。5.2.6加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清，37湿盒中作用1h或3：盒作用30in后4过夜。5.2.7漂洗同5.2.4.
