1、第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）冷冻电镜样品制备的生物安全评估李锶铎，莫若衡，孙琳钧，黄宇轩，贾旭东，张勤奋（中山大学 生命科学学院，有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东 广州）摘 要 冷冻电镜是发现、鉴定病原微生物，解析病原微生物结构的有力工具。对冷冻电镜的实验过程中，样本是否会扩散到环境中导致污染，继而引发生物安全的问题，国内外目前都缺少相关实验探究。本研究利用当前广泛使用的直接投入式冷冻电镜样品制备设备，对病毒和细菌样品进行冷冻电镜样品制备，探究冷冻电镜制样过程中可能出现的样品泄露以及造成的污染问题，进行生物安全评估。实验结果表明：被滤纸吸附的样品可透
2、过滤纸进一步污染制样设备，使用封口膜可有效避免样品进一步污染；病毒性样品实验结果表明即使用封口膜也可由多种原因而扩大污染范围。这些结果为冷冻电镜样品制备生物安全评估提供了实验依据。关键词 生物安全；冷冻电镜制样；大肠杆菌；杆状病毒中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：广东省科技计划项目资助（）共同第一作者：李锶铎（），男（汉族），广东人，学士：莫若衡（），男（汉族），广东人，学士：孙琳钧（），男（汉族），内蒙古人，学士：黄宇轩（），男（汉族），江西人，学士：通讯作者：张勤奋（），女（汉族），江苏人，副教授：近几年随着各方面技术的突破，冷冻电子显微镜（，）在病毒和其它病原的整
3、体形貌、蛋白质结构以及材料等方面的研究与应用发展迅速，成为结构生物学中解析微观物质三维结构的重要工具。利用冷冻电镜解析病原微生物结构可以为病原鉴定与结构解析、疫苗与药物设计等方面提供关键信息。对于具有强烈传染性的病原微生物，其培养、动物感染实验等可能有潜在病原泄露风险的实验操作必须在与病原微生物危害程度相对应的生物安全实验室（）中进行。冷冻电镜观察样品前如果对未灭活的病原微生物进行冷冻电镜制样，属于未经培养的感染材料的操作，同样需要按照有关要求在相对应的 中进行。具有生物安全隐患的病原微生物等样品在进行冷冻电镜研究时，可能存在样品扩散、污染的环节主要包括以下 个：第一个环节是冷冻电镜样品制备过
4、程。冷冻电镜制样需要将样品快速保存在薄层的玻璃态冰中。这个过程中，样品的浓度和纯度比常温的负染色技术所要求的都高很多。这个阶段的样品的数量相对于后续的过程也是最多的；另一方面，为了获得样品天然活性状态的形态结构，保存在溶液中的样品一般都具有活性。因此这个阶段对病原样品进行任何操作都具有很高的生物安全隐患。第二个重要环节是冷冻样品存储和转移过程。样品一旦经过快速冷冻制样，就被迅速固定在玻璃态的冰并保存在液氮中。在样品存储的液氮环境突然升温，或者从液氮转移到特制的低温样品杆或其它转移设备，并继续转移到电镜中观察前的整个过程中，一旦由于操作不当等原因而导致样品升温、玻璃态冰解冻、液氮挥发等现象，样品
5、有可能随玻璃态冰变成水或水蒸气而扩散，引发生物安全问题。第三个环节是电镜观察过程和观察后的转移过程。电镜观察过程中有可能由于电子束照射时间过久或设备故障导致样品升温，电镜中载网上的样品就有可能随着玻璃态冰的解冻挥发而扩散，继而被电镜真空系统泵出镜筒，释放到环境中造成生物安全隐患。观察后的转移同样也有可能因为操作不当等引起升温导致污染。其中，第二和第三个环节中，保留在载网上的样品数量跟样品制备初期相比已经很少，生物安全的隐患也相对降低。目前，全球仅有英国牛津粒子成像中心以及美国德克萨斯大学医学院具有集成冷冻电镜的 第 期李锶铎等：冷冻电镜样品制备的生物安全评估 实验室开展病原微生物的鉴定、病原宿
6、主相互作用以及结构解析等方面的研究，并对载网、样品转移后环境消杀和电镜观察等环节中存在的生物安全风险处理等进行了探索。但国内现有的 及以上的实验室均未配置冷冻电镜。对于高感染风险的病原微生物的结构解析工作，通常将其灭活后在较低等级的 中开展。到目前为止暂无报道冷冻电镜制样过程是否存在样品泄露和污染情况的研究。现有商品化冷冻电镜制样设备往往在产品说明书中提醒用户在相应等级 中进行并有一定的指引，但冷冻电镜制样过程中是否存在样品污染的情况并不清楚。虽然近年来陆续出现一些新产品，如对样品采用直接“书写”的方式加载到载网上，继而快速投入冷冻。目前在用的大多数快速冷冻样品方法，仍需要在载网上滴加足够多的
7、样品，并用滤纸吸弃大部分，从而只保留一薄层样品溶液在载网上，并快速冷冻制备玻璃态冰层。该冷冻制样过程中绝大多数样品溶液被吸附到滤纸上，该滤纸及其接触的环境是第一个可能引起生物安全问题的环节。此外，极少部分留在载网上的样品在制成薄玻璃态冰的过程中，是否会随着液氮、液态乙烷挥发而形成气溶胶散落到周围环境，这是第二个令人关注的环节。此外，部分操作步骤不当也有可能造成周围环境的污染。为了探究这些环节和环境的样品扩散与污染情况，本文使用大肠杆菌工程菌作为细菌样品代表；使用能作为生物农药、对有害昆虫致病，并常用于真核生物表达载体的杆状病毒代表种苜蓿银纹 夜 蛾 核 多 角 体 病 毒（，）作为病毒样品代表
8、，完成冷冻电镜制样污染检测，探究操作中是否会出现样品泄露污染实验环境的情况，并提出相应的解决方案。材料与方法 材料 重组大肠杆菌（具有卡那霉素抗性）和核多角体病毒 由本实验室保存并提供。方法 重组大肠杆菌样品制备 参考文献培养大肠杆菌，使用含有卡那霉素的固体培养基接种重组大肠杆菌，并挑取单菌落置于含卡那霉素的 液体培养基在 ，条件下培养过夜。用分光光度计测定菌液 值。当 等于 时，停止培养。取 过夜培养菌液，离心 ，弃上清液，保留约 液体重悬沉淀，电镜下负染检测纯度与浓度，作为冷冻制样的细菌样品。核多角体病毒 样品制备 参考文献提纯核多角体病毒，具体做法：用细胞计数的方法，调整从虫体中获得的多
9、角体浓度至 个。吸取 多角体悬液，加入含有 碳酸钠，氯化钠，的多角体裂解液 ，水浴裂解后，用约 为 的磷酸缓冲液混匀，马上用 左右离心 。上清用 离心 ，取沉淀用约 为 的磷酸缓冲液重悬离心沉淀的病毒（此时病毒浓度约为 ），使用负染色法制样，电镜下观察病毒的形态、纯度，作为冷冻制样的病毒样品。冷冻制样细菌样品污染检测 如图 所示，使用赛默飞 进行冷冻制样，在冷冻制样前后分别对环境、样品腔室、设备部件进行取样。（）使用 乙醇对操作台周围区域进行消杀，并在周围取样区域铺上新鲜保鲜膜，的样品腔室同样进行消毒，并如图 所示安装好滤纸、封口膜和设备部件，三张滤纸分别标记为，；由于常规制样，接触和吸附样品
10、的滤纸后面的设备部件是一层海绵垫，容易把透过滤纸的样品吸进海绵内，难以用拭子取样。因此实验中用的滤纸 和 取代设备部件海绵垫取样。（）用无菌水润湿无菌拭子，使用拭子擦拭操作区域、腔室，分别放入到含有卡那霉素的 液体培养基中并做好标记。（）取 备好的细菌样品滴加在已经亲水处理的铜网上进行冷冻制样，用 个载网分别在两面滴加样品，并按常规冷冻制样步骤进行制样，以保证左右两边滤纸分别同等条件吸附样品。冷冻制样滤纸吸附时间（）为 ，吸附力度（）设为。（）完成冷冻制样后，小心取下装置左右两侧的滤纸，裁剪至合适大小，分别放入到含有卡那霉素的 液体培养基中并做好标记。（）再用无菌水润湿无菌拭子，并擦拭操作区域
11、、腔室，分别放入到含有卡那霉素的 液体培养基中并做好标记。完成采样后，对实验室环境、以及镊子 电子显微学报 第 卷图 冷冻制样过程的污染采样位置示意图。，表示不同位置的滤纸；表示样品腔室；表示环境。，；等器材进行消毒。对已采集样品按照 中提到的方法，液体培养基中培养 ，每隔 使用分光光度计进行 检测。以上实验重复三次。冷冻制样病毒样品污染检测 取样前，配制病毒裂解液：含 线性丙烯酰胺的 盐酸胍溶液，并在其中加入蛋白酶。（）按照 同样方式制样，并在同样位置取样。（）剪碎所取样的滤纸、拭子分别放入到含有病毒裂解液的离心管中并做好标记。（）实验取样结束后，对环境和设备进行消毒。（）将上述第 步中的裂
12、解液置于 水浴加热 并不时轻柔地混匀，然后转移到 水浴加热 使蛋白酶 灭活。待离心管冷却后加入等体积预冷的异丙醇并混匀，放入 冰箱静置 ，离心 ，弃上清液，打开管盖于室温静置干燥 后，加入 缓冲液重悬沉淀。根据 衣壳蛋白 基因设计一对引物 和 ，将悬液进行聚合酶链式反应（）扩增，如表 所示配制 反应体系。表 反应体系（）（）（）：反应条件设置如下：，次循环 ，产物进行 琼脂糖凝胶电泳。结果 细菌和病毒样品负染检查 对所获得的细菌和病毒样品进行负染色检查（图）。结果显示细菌和病毒样品形态结构完整，纯度和浓度等基本符合冷冻电镜样品制备条件。冷冻制样细菌性污染检测 不同采样点的大肠杆菌的 随时间变化
13、如图 所示。可见滤纸 和 上的样品，在培养 后 出现明显增长，表明上面残留有实验用重组大肠杆菌，滤纸 在培养液中培养同样时间，与阴性对照相当，说明没有明显样品污染。以上结果表明进行冷冻电镜制样过程中，吸附样品的滤纸有细菌残留，并且可随着液体扩散到后面紧靠该滤纸的设备或滤纸上。在滤纸后面垫一层疏水的封口膜可以有效防止样品通过吸附样品用的滤纸扩散引起的污染。冷冻制样病毒性污染检测 不同采样点的样品 产物的琼脂糖凝胶电泳图如图 所示，可见阳性对照泳道（图 泳道）、滤纸（图 泳道）和滤纸（图 泳道）均在约 处出现条带，与目的条带大小相当，说明有病毒样品残留。其余泳道相应的地方没有出现目的条带，没有检测
14、到样品残留。第 期李锶铎等：冷冻电镜样品制备的生物安全评估 图 样品负染色结果。重组大肠杆菌负染色图，；核多角体病毒 负染色图，。；图 不同采样点样品培养液的 随时间变化情况。，和 指图 相应位置中的滤纸；表示冷冻制样前的环境采样组；表示冷冻制样后的环境采样组；表示冷冻制样前的设备腔室采样组；表示冷冻制样后的腔室采样组；表示阳性对照，表示空白对照。，；滤纸 中残留样品的 产物也有一条目的条带，说明病毒样品可能比较容易扩散、容易在操作过程形成气溶胶、或者操作中容易形成污染等，导致即便使用封口膜间隔，仍然存在病毒扩散和污染的危险。讨论 细菌性污染检测实验结果表明，样品可以通过滤纸扩散到其后面的设备
15、部件上，而在吸附样品溶液的滤纸和设备部件间增加一层疏水的封口膜可 电子显微学报 第 卷图 产物琼脂糖凝胶电泳结果。和 泳道分别代表样品取自图 相应位置中的滤纸上的样品；泳道 样品采集自冷冻制样前的环境；泳道 样品采集自冷冻制样后的环境；泳道 样品采集自冷冻制样前的腔室；泳道 样品采集自冷冻制样后的腔室；表示阳性对照；表示空白对照；表示；白色箭头表示目的条带（约 ）。；（）以有效防止样品污染。病毒性实验结果表明即使增加封口膜保护部件，仍可能引起部件被样品污染。不能排除操作不当引起，但更可能的原因是病毒样品扩散和污染能力更强。因此进行冷冻制样后需要使用消毒剂严格对实验仪器、操作人员和环境进行仔细消
16、杀才可防止样品扩散造成污染。实验过程中，作者对细菌性污染检测采用了培养液培养的方式继而通过测定 值来判断污染是否存在。细菌培养比较简单方便，通过扩大培养，可以对微量的污染样品进行扩增，增加灵敏性。实验过程中，有可能环境中本底存在极微量的杂菌，因此本文也对工程菌种导入的抗性基因进行特异性鉴定，排除了可能的假阳性。对于病毒性污染检测实验，本文采用了 扩增的方式。由于病毒培养需要首先培养其宿主细胞，宿主细胞培养条件相对复杂，对极微量病毒检测的影响因素和难度增加。而采用特异引物进行 扩增的方法操作简单，灵敏度高。病毒性污染检测实验中，在未有目的条带的样本中，观察到比较明显的核酸条带拖尾现象。这是因为本项目在常规病毒核酸提取过程中，考虑到检测样本量比较少，灵敏度的提高非常重要，为此，作者使用含有蛋白酶、线性丙烯酰胺的裂解液处理拭子采样得到的样品以及吸附在滤纸上的样品，经过高温灭活蛋白酶、异丙醇沉淀离心后将沉淀直接进行。多次实验表明该方法的灵敏度比现有多个商品离心柱纯化法更高，可以检测到环境中极微量的病毒的存在，从而更加严谨地评估冷冻电镜制样的样品泄露情况。该方法对实际环境微量病原检测有一定的潜在
