1、收稿日期：基金项目：河北省重点研发计划项目（）作者简介：闫蓉蓉（），女，在读硕士，研究方向为食品过敏原的快速检测与控制。通信作者：李书国（），男，博士，教授，研究方向为食品加工原理与安全控制。免疫传感器在快速检测食物过敏原的应用研究闫蓉蓉，李书国（河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄）摘 要：介绍了免疫传感器的原理、分类及其电化学构建方法，综述了免疫传感器在食物过敏原检测中的应用，并针对免疫传感器技术目前存在的问题和发展前景进行了讨论和展望，以期为免疫传感器技术发展提供参考。关键词：免疫传感器；电化学；过敏原；快速检测 ，（，）：,:;中图分类号：文献标志码：文章编号：（）近年来食物过敏的发
2、病率不断升高，需要引起足够重视。目前食品中过敏原的检测方法主要有液相 气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法、环介导等温扩增技术等，虽然这些方法灵敏度和准确度高，但存在耗时长、价格昂贵、操作复杂等缺点。与仪器方法相比，免疫传感器技术具有特异性好、灵敏度高、操作简单、耗时短、成本低等优点，可用于食物过敏原的痕量检测。本文介绍了免疫传感器的工作原理、主要类型、电化学免疫传感器的构建方法等，综述了免疫传感器在食品过敏原检测方面的最新进展，并针对免疫传感器技术存在的问题及发展前景进行思考和展望，希望能为免疫传感器技术的进一步发展提供参考。免疫传感器的原理与分类 免疫传感器的原理免疫传感器是基于抗原抗体特异
3、性识别功能而研制成的一类新型生物传感器，具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等优点，其应用已涉及临床医学与生物监测技术、食品工业、环境监测与处理等领域。该类生物传感器是通过抗体（）与抗原（）的特异性结合，从而形成稳定的复合物。抗体抗原结合位点数量会对免疫传感器的光电信号产生影响，而溶液、孵育温度和缓冲液浓度等对 的特异性结合强度及位点数量具有显著 作 用，进 而 也 会 影 响 其 免 疫 响 应 信 号 的大小。免疫传感器的分类根据是否使用标记物，免疫传感器分为间接型或直接型（即标记型或非标记型）免疫传感器。前者需要采用标记物（酶、金属标记物、同位素、荧光试剂等），通过结合免疫标记复
4、合物产生的响应信号来实现检测的模式或手段，该方法灵敏、方便。后者无需采用标记物，即可在免疫复合物的形成过程中通过换能器上信号的变化直接展开检测。根据使用的换能器不同，免疫传感器可分为电化学免疫传感器、光学免疫传感器和压电免疫传感 年第 卷第 期 粮食与油脂器等。电化学免疫传感器是将抗原抗体特异性结合的免疫分析方法与电化学结合的 种传感器，检测速度快，灵敏度高。光学免疫传感器是通过测量免疫反应前后光学信号的变化值来实现检测目的的传感器，磷光、荧光都可以作为光信号。压电免疫传感器是利用电介质受力后产生的压电效应制成的传感器。电化学免疫传感器的构建目前，电化学免疫传感器领域面临的关键问题是抗原和抗体
5、结合的微弱信号如何转化成足够强的电化学信号，再进行放大处理，从而提高检测灵敏度、增大响应电流以及提高免疫传感器的稳定性。选择合适的抗体 单克隆抗体由 与 制备的单克隆抗体系统是采用免疫鼠系的免疫 细胞浆细胞瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系，可产生单一特异性、纯化的抗体，此融合细胞是通过反复克隆得出，克隆细胞产生的抗体在特异性、氨基酸序列、分子结构等方面皆保持一致，故称作单克隆抗体。单克隆抗体具有交叉反应少、效价高、亲和力强、特异性高等优点，在免疫传感器与免疫测定等方面具有重要作用。多克隆抗体多克隆抗体是把抗原注入动物体内，由动物体内 细胞产生的抗体。由于多数抗原分子具有多种抗原决定簇，因此可以刺激
6、多个 细胞克隆产生针对多种抗原决定簇的混合抗体。由于在免疫血清中有一些不相关的杂蛋白质或非特异性的免疫球蛋白分子，在免疫传感器测定中，这些杂质会影响特异性抗原与抗体的结合量，降低灵敏度，因此要对抗体展开纯化。抗原（或抗体）的固定构建电化学免疫传感器，必须要将抗原（或抗体）固定在机体传感器表面，固定方法对传感器的选择性、灵敏度、稳定性等有直接影响，是免疫传感器领域的研究热点。常用的固定方法有蛋白 法、交联固定法、包埋固定法、吸附固定法等。材料的合理利用 新型纳米材料的应用纳米材料的主要优势在于其固定生物活性剂的能力，在纳米材料发展之前，这种固定化是随机的，不稳定，容易导致酶和其他生物活性剂的变性
7、。生物活性剂必须通过共价键固定，因为非共价键可能导致、温度和离子对键合蛋白的敏感性。共价键合的理想材料是纳米金、纳米银、二氧化铈等金属氧化物纳米材料，其中纳米金还具有光学特性，可增强与抗原和 核苷酸等生物活性目标的相互作用。纳米金易于操作和合成，同时具有可重定尺寸、稳定、与多种生物活性剂相容的特点，可用于检测强烈的红色光谱。标记修饰方法可以提高纳米金粒子在比色分析法的精度，标记酶如辣根过氧化物酶（）可通过催化某些生化反应形成过氧化氢，而相关的增强剂如，（，）四甲基联苯胺（）和 氨基乙基咔唑（）可与过氧化氢反应，从而通过增强颜色反应来加强与背景的信号对比度，并提高检测灵敏度。比色法的肉眼检测要求
8、极高的灵敏度和较高的分析物浓度，而纳米金、石墨烯、二氧化铈和碳纳米管等纳米材料可以检测低浓度靶点，并清晰显示比色信号，因此其检测灵敏度较高，同时也可降低比色标记分析或诊断方法成本。荧光纳米颗粒是食品过敏原检测所用光学纳米材料的替代品，其中应用最多的荧光纳米颗粒是量子点，作为适配体和抗体的直接标记物，其精度可以达到纳米级及以下，检测灵敏度更高。量子点可以与其他纳米材料（如二氧化硅）结合以提高表面体积比，并将检测限提高到纳米金材料的 倍以上。磁性纳米材料具有磁化作用和更高的表面体积比，可适应生物、物理和化学领域的界面。磁性纳米颗粒由 个磁芯和 个非磁性壳组成，通过与其他材料结合而发生活化，从而在复
9、杂的食物基质中与目标过敏原分析物结合。最常用的接合试剂是抗体、碳二亚胺交联剂和适配体。适配体作为生物感受器，更容易合成和修饰、重复性高、保存期长，因此其性能优于抗体。聚合物材料的应用 惰性聚合物惰性聚合物薄膜本身导电性差、缺乏电活性，因此很难在电极表面生长，即随着扫描圈数增加，聚合电流会逐渐减小。在较宽的电势区间内，惰性聚合物薄膜不会产生氧化还原电流，但能够选择性响应氢离子、有效防护金属表面。惰性聚合物薄膜作为修饰材料可用于固定生物分子或者利用其选择渗透性降低干扰物质的响应信号以提高检测的粮食与油脂 年第 卷第 期选择性。聚氯乙烯、聚邻苯二胺、聚酚等属于常见的惰性聚合物薄膜。王国稳等用电聚合方
10、法制备邻苯二胺聚合膜（）修饰电极，并用循环伏安法（）探讨有机磷农药毒死蜱在该修饰电极上的电化学行为，该方法检出限为 。导电聚合物生物 化学修饰电极（传感器）常用的电聚合物主要包括聚噻吩、聚苯胺、聚吡咯及其相关衍生物，它们均有长程共轭结构，具有良好的导电性和成膜性，是良好的固定化修饰材料，可显著增强电极与电活性物质之间的电子传递，或者催化电活性物质的电化学氧化还原反应，使电化学分析的灵敏度显著提升。席慧婷利用聚吡咯和金纳米粒子制备了 电化学传感器，用于检测牛乳中的甲醛，检出限为 ，效果良好。离子液体的应用离子液体（）通常指有机阳离子和无机或有机阴离子构成的盐类化合物，在室温下呈液态，特点是熔点低
11、，具有可调控性。离子液体还具有较高的黏度，在电化学分析中可以作为黏合剂与石墨粉粘结来制备电极。等采用（氯羟基丙基）吡啶醋酸盐作为黏合剂制备成；等以 丁 基 吡 啶 六 氟 磷 酸 盐 制备 电极。免疫传感器在常见食物过敏原检测中的应用 花生过敏原目前已有许多关于花生过敏原 、和 的检测报道。等利用金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极，研制了双单克隆抗体夹心型电化学免疫传感器，用于检测花生过敏原 ，检测限低至 ，已成功应用于饼干、巧克力等复杂食品基质中 的检测。花生过敏原 可以通过磁性安培免疫传感器检测，该传感器使用了以抗 抗体复合物为目标的羧酸磁珠，磁珠用于表面涂层的丝网印刷电极上捕获 标记的抗体。
12、氢醌电子介体用于转移由银伪参比电极监测的抗体活性反应。制备 小麦粉样品只需简单稀释，利用市售的 试剂盒对磁性生物传感器的检测结果进行验证，确定的线性检测范围为 ，检出限为 。小麦过敏原醇溶蛋白是小麦、黑麦、大麦等谷物及其制品中的主要过敏原，会引起腹腔疾病和其他过敏问题。利用石墨电极和脉冲伏安法设计的电化学生物传感器可以检测麦醇溶蛋白，在最佳条件下，传感器的线性检测范围在 ，检出限为 。利用无标记氧化石墨烯及其氧化还原机制设计电化学生物传感器，检测线性范围为 ，检出限为 ，可重复使用，有效降低检测成本。醇溶蛋白也可以通过石英晶体微天平和光子固定系统的组合来检测，以空间定向抗醇溶蛋白抗体。利用压电
13、换能器从表面功能化和金纳米粒子实现了稳健、低成本的抗体信号转导。这种基于石英晶体的免疫传感器十分可靠，反应敏感，可定量分析，并且具有较低假阳性率，已经通过 试剂盒验证，其醇溶蛋白的检测范围为 ，检出限为 。虾过敏原虾中含有的原肌球蛋白可引起严重的过敏反应。等研制了 种电化学生物传感器用于检测原肌球蛋白变应原 ，得出传感器检测过敏原 的线性范围为 ，检出限为 。等利用包裹的嗜碱性白血病细胞和涂有二氧化硅层的 纳米颗粒开发的电化学生物传感器，过敏原 的检出限为 ，鱼肉过敏原 的检出限为 。牛乳过敏原牛乳过敏一般是对牛乳中的蛋白质过敏，其过敏原主要有 乳球蛋白（）、乳白蛋白（）、酪蛋白（）等。等研制
14、出 种新型的低成本一次性基于肥大细胞的纸基传感器，用于定量检测酪蛋白，结果表明免疫响应电流值与酪蛋白浓度成正比，检出范围为 ，检出限为 （%）。电化学分析法的结果与常规分析方法（液质联用法和酶联免疫法）结果一致，表明该方法可用于食品过敏原的定量检测。等运用石墨烯修饰的丝网印刷碳电极，研制出 种新型无标记电化学免疫传感器，用于检测牛奶过敏原 乳球蛋白，检测线性范围为 ，检出限达到 。此免疫传感器对蛋糕、奶酪点心、甜饼干在内的不同样品做检测，所得结果与通过商业 方法得到的结果具有良好的相关性。等采用选择性捕获和辣根过氧化物酶标记检测抗体的夹心型结构，构建出 种基于非常 年第 卷第 期 粮食与油脂灵
15、敏的磁珠（）免疫传感器来测定。结果表明，免疫传感器检测 线性范围为 ，检出限为 。基于 的免疫传感平台已成功应用于多种牛乳（生牛乳、牛乳和人乳）和婴儿配方中 的测定，结果与商业 方法得到的结果一致。结论与建议免疫传感器技术是集合免疫学、纳米技术、计算机科学、生物信息学等技术于一体的免疫检测方法，具有高灵敏度、精确性和特异性好等优点，可实现快速检测、在线检测，样品预处理简捷，但为了进一步提高免疫传感器在食物过敏原检测方面的性能，需要从以下几方面进行深入研究：（）研究开发抗体固定化新材料、新方法、新技术，构建生物相容性优良的抗体抗原免疫反应的微环境，提高抗体固载量、保护抗体的活性；（）研究开发生物
16、相容性好、导电性好、有催化性能、环保型的新型纳米材料或电子介体材料，放大免疫响应电流，提高食物抗原检测灵敏度和精确度；（）研究开发微型化、阵列化、多通道、高通量的免疫传感器，可同时检测多种抗原，以提高检测的通量和检测效率；（）研究开发核酸适配体生物传感器，可用于食物过敏原如花生过敏原 、醇溶蛋白和 乳球蛋白等的检测；（）加强快速灵敏、便携的检测设备的研发，可利用大数据、可视化、信息化、智能化技术等开发基于抗体抗原免疫响应或核酸适配体分子探针的现场快速检测设备，以满足实际应用需求，提高检测水平和检测效率。参考文献 ,():,:,():,:,:,:,:,:汤琳,曾光明,黄国和,等 免疫传感器用于环境中痕量有害物质检测的研究进展 环境科学,():吴健民 临床化学自动化免疫分析 北京:科学出版社,():,:,():,():,():王国稳,陈宗保,陈淑芬 聚邻苯二胺修饰玻碳电极电化学方法测定水样中毒死蜱农药残留 上饶师范学院学报,():席慧婷 纳米金粒子聚吡咯复合电化学传感器的构建及对牛乳中甲醛的检测 南昌:南昌大学,():,():,():（下转第 页）粮食与油脂 年第 卷第 期,:,:,():
