1、3期691晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的转录组学分析袁畅1，李蔚2，何苹萍2，陆专灵2，黄彬胜2，王大鹏2*，李文红1*（1广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；2广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁530021）摘要：【目的】运用转录组测序技术探究不同晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的基因表达变化，筛选出与其卵巢发育相关的候选基因及信号通路，为研究晒田胁迫方式促进克氏原螯虾卵巢发育的作用机制提供理论依据。【方法】以雌性克氏原螯虾为研究对象，分别在晒田环境胁迫0 d（CK）、3 d（T1）、7 d（T2）和10 d（T3）时采样，构建卵巢cDNA文库进行转录
2、组测序，对差异表达基因（DEGs）进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析。【结果】共获得86377个Unigenes，在Nr、KOG/COG、Swiss-Prot和KEGG库中成功注释到22712个Unigenes；获得1115个胁迫组（T1、T2和T3）与CK的DEGs。KEGG信号通路富集分析结果表明，DEGs富集的PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路和雌激素信号通路与卵巢发育相关。实时荧光定量PCR验证结果表明，3个DEGs的表达模式与转录组分析结果基本一致，证明转录组数据准确可靠。筛选得到B2M、TUBA1B、MT-CYB、MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4、DSX、P
3、ck2、PIM3和serine prote-ase nudel-like等10个与卵巢发育相关的DEGs，并对其表达量进行分析，结果表明各基因在晒田胁迫期间均可调控卵巢发育。【结论】B2M、TUBA1B、MT-CYB、MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4、DSX、Pck2、PIM3和serine protease nudel-like等10个DEGs及PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路、雌激素信号通路等3个富集通路在晒田胁迫期间参与卵巢发育调控。关键词：克氏原螯虾；卵巢；发育调控；晒田环境胁迫；转录组中图分类号：S966.12文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）0
4、3-0691-13收稿日期：2022-06-02基金项目：广西创新驱动发展专项（桂科AA20302019-3）通迅作者：王大鹏（1981-），https:/orcid.org/0000-0002-3714-8936，博士，副研究员，主要从事水产养殖技术研究工作，E-mail：；李文红（1966-），https:/orcid.org/0000-0003-1235-8408，博士，教授，主要从事水产养殖技术研究工作，E-mail：第一作者：袁畅（1996-），https:/orcid.org/0000-0003-4554-0687，研究方向为克氏原螯虾工厂化繁育，E-mail：南方农业学报Jour
5、nal of Southern Agriculture2023，54（3）：691-703ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.005Transcriptomic analysis of ovary of Procambarus clarkii undersun-drying environmental stressYUAN Chang1，LI Wei2，HE Ping-ping2，LU Zhuan-ling2，HUANG Bin-sheng2，WANG Da-peng2*，LI Wen-ho
6、ng1*（1College ofAnimal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2GuangxiAcademyof Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory ofAquatic Genetics，Breeding and Healthy Breeding，Nanning，Guangxi530021，China）Abstract：【Objective】The purpose of the study was to explore the gene ex
7、pression changesin ovaries of Procam-barus clarkii under different sun-drying stresses by transcriptomic sequencing technology，and to screen outthe candidategenes and signaling pathways related to ovarian development，so as toprovide a theoretical basis for studying the mecha-nism of sun-drying stres
8、s in promoting the ovarian development of P.clarkii.【Method】The female P.clarkii were sam-pled at 0 d（CK），3 d（T1），7 d（T2）and 10 d（T3）of sun-drying environmental stress，and ovary cDNA libraries wereconstructed for transcriptome sequencing，and the differentially expressed genes（DEGs）were subjected to
9、GO functionalannotation and KEGG signaling pathway enrichment analysis.【Result】A total of 86377 Unigenes were obtained.Ofthese，22712 Unigenes were successfully annotated in Nr，KOG/COG，Swiss-Prot and KEGG databases.A total of 1115DEGs were obtained between the stress group（T1，T2，T3）and the CK.The res
10、ults of KEGG signaling pathway enrich-ment analysis showed that DEGs enriched on the pathways associated with ovarian development，including PI3K-Aktsignaling pathway，GnRH signaling pathway and estrogen signaling pathway.The real-time fluorescence quantitative54卷南 方 农 业 学 报 6920引言【研究意义】克氏原螯虾（Procamba
11、rus clarkii）又称小龙虾，在20世纪初被引入我国，是我国养殖面积最广和产量最大的淡水虾，也是淡水水产出口创汇的主导产品。克氏原螯虾广泛分布于湖北、江苏等省份，由于冬春季市场价格过高，其人工养殖产业逐渐向气候温暖适宜的华南地区发展。克氏原螯虾的主要养殖模式为稻田养殖，效益最佳的冬闲田养殖阶段在每年10月至次年4月；获得苗种的主要途径为人工繁殖，出苗量最大的长江中下游地区供苗高峰期在每年46月，与冬闲田养殖存在时间差。为保障秋冬季养殖的苗种供应，提高苗种产量，优化繁育促熟技术迫在眉睫。克氏原螯虾繁殖期时间跨度大，雌雄交配现象在每年春冬季外的大部分时间均可发现，当雌虾卵巢未成熟时也会发生交
12、配，交配后，雄虾精子排入雌虾纳精囊内保存，直到卵巢成熟、排卵，产生抱卵现象（王庆，2012；徐增洪等，2014）。生产实践表明，晒田能提高克氏原螯虾卵巢成熟的同步性，促使其提前抱卵，提高抱卵同步率，且具备杀灭敌害生物的效果，在生产上已广泛使用。因此，了解晒田促熟卵巢的分子机制，对发展新的繁殖相关技术具有重要意义。【前人研究进展】转录组测序技术已广泛应用于水产动物的病原体感染（Lee et al.，2021；Liu et al.，2021；Yang et al.，2022）、免疫调节（Jiao et al.，2019；Jiang et al.，2021；Dinget al.，2022）、神经调节
13、（Veenstra，2015；He et al.，2019；Costa et al.，2021）和性腺发育（Wang et al.，2020；Zheng et al.，2021；Zhong et al.，2021）等方面的分子机制研究。近年来，转录组技术作为研究虾类性腺发育的重要手段，对探寻提升虾类繁殖性能具有重要意义。相关报道表明，在克氏原螯虾中，DNA复制、细胞周期、错配修复、嘧啶代谢、减数分裂酵母和核苷酸切除修复等KEGG通路及Vg、cyclinB、CDK2和Dmc1等差异基因共同参与调节性腺发育（Jiang et al.，2014；Shen et al.，2014）；对雌性斑节对虾（P
14、enaeus monodon）投喂多毛类动物并切除单侧眼柄后，参与调控脂肪酸调节、能量生成和激素介导卵母细胞成熟等通路的重要基因，如MAPKK、PGM-RC1及cytochrome等高表达，协同诱导卵巢成熟（Sit-tikankaew et al.，2020）；日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）卵巢在繁殖期间可快速且周期性成熟，其溶酶体通路中富集的相关基因cathepins、legu-mains和cystatin，可保护卵黄原蛋白水解，且myosinheavy chain 67参与了卵母细胞的排出（Zhang et al.，2021）；通过增加甘油三酯和甾醇等营养物质的
15、含量及提高雌激素、雌二醇、甲基法尼苷等相关激素的分泌，从而促进雌性南美白对虾（Litopenaeus vanna-mei）卵巢发育（Liang et al.，2022）。根据有关研究报道，温度（张聚涛，2011；王庆等，2012）、隐蔽物（宋光同等，2015）、光照（孙珂，2019）等环境因素可促进克氏原螯虾卵巢成熟，通过温棚反季繁育（文玲梅等，2018；刘国峰等，2021；宋光同等，2022）及工厂化离体繁育（许洪杰等，2020）等方式可促进亲虾繁育，但还未有生产技术可实现克氏原螯虾卵巢稳定成熟。环境胁迫会影响能量的最佳分配，包括生长、繁殖和储存等（Sokolova，2013）。卵黄是胚胎发
16、育主要的能量储备，卵黄生成的平衡改变可能会导致严重的生殖障碍（Arambourou et al.，2020）；纳米聚苯乙烯（PS NPs）与除草剂阿特拉津胁迫克氏原螯虾卵巢发育，导致其卵黄原蛋白（Vtg）表达下调、卵母细胞较小（Silveyra et al.，2018；Capanni et al.，2021）；萘会引起卵巢封闭，促使卵黄发生前期和卵黄发生期的卵母细胞退化（Sarojini et al.，1995）。但也有学者曾尝试利用胁迫因素加强克氏原螯虾卵巢发育，以了解其发育的分子机制，曾有研究发现使用法尼酸甲酯（MF）胁迫可刺激卵母细胞成熟，促进卵巢成熟（Laufer et al.，1998）。【本研究切入点】目前，生产中已广泛使用晒田方式对雌虾卵巢进行促熟，进而提高克氏原螯虾的繁殖能力。但晒田促熟卵巢的分子机制尚不明确，仍需深入探讨。【拟解决的关键问题】PCR verification results showed that the expression patterns of the three DEGs was basically consistent with the re
