1、收稿日期：。基金项目：国家自然科学基金资助项目（）。作者简介：冯思麟（），男，硕士生。通信作者：万茵（），女，教授，博士。：。冯思麟，范浩伟，马文婧，等栀子苷与热处理大豆分离蛋白相互作用机理南昌大学学报（理科版），（）：，（），（）：栀子苷与热处理大豆分离蛋白相互作用机理冯思麟，范浩伟，马文婧，赵富强，谢芳，罗竞成，舒佳，付桂明，万茵 （南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室；国际食品创新研究院，江西 南昌 ；欧思麦集团有限公司，江西 南昌 ）摘要：为探究栀子苷与不同热处理大豆分离蛋白的相互作用的机理，以 电位、粒径及微观样貌观察（）为指标对栀子苷热处理大豆分离蛋白复合物进行表征，并采用荧光光
2、谱法探究栀子苷与不同热处理大豆分离蛋白之间的淬灭方式、结合位点数、结合作用力类型。结果表明，栀子苷会使热处理大豆分离蛋白的 电位绝对值增大，粒径减小，且栀子苷与 热处理大豆分离蛋白的复合物 电位绝对值最大，粒径最小；栀子苷与热处理大豆分离蛋白之间淬灭过程是自发的，机制为静态淬灭，相互作用类型为范德华力和氢键，并形成了结合位点数近似于的复合物。关键词：相互作用；大豆分离蛋白；栀子苷中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（；，；，）：，；，：；栀子苷（，），属环烯醚萜苷类化合物，是 茜草 科植物栀子（）中的主要活性成分，其结构如图所示，具有抗抑郁、抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗氧化和第 卷第期 年月南
3、昌大学学报（理科版）（）DOI:10.13764/ki.ncdl.2023.01.007神经保护作用等多种药理作用，研究价值和临床应用价值极高。但栀子苷稳定性差、生物利用度低，对其的研究、开发和应用受到了极大限制。图 化学结构 大豆分离蛋白（，）作为健康膳食金字塔中主要来源的蛋白质，因其作为植物蛋白在健康中的独特营养价值及优良的功能特性，广泛地使用在食品工业中。研究表明温度可显著影 响 的 二 级 结 构 和 功 能 特 性。陶 汝 青等 发现，随着 热处理温度从 变化到，形成凝胶的强度先升高后降低，凝胶失水率呈下降趋势。郭凤仙等 发现较低浓度的 在适宜高温条件下热处理一定时间会改善 的溶解性
4、，起泡性和乳化稳定性也会受到一定的影响。一般认为是 主要组分 球蛋白和 球蛋白 遇高温易变性所致。因其两亲性常被用于运载和保护各类天然生物活性物质。代世成等 通过制备大豆分离蛋白（）儿茶素非共价共价复合物来提高儿茶素的抗氧化能力和稳定性。为利用 运载和保护栀子苷，本实验以 电位、粒径及微观样貌观察（）为指标对所制备的复合物进行表征，采用荧光光谱探究 与 之间的相互作用力，分析不同热处理条件对二者相互作用和结合方式的影响，以期为改善栀子苷的实际应用提供理论依据。材料与方法材料与试剂栀子苷（分析纯，）购于陕西金康泰生物科技有限公司；大豆分离蛋白（分析纯，）、栀子苷标准品（，）购于美国 公司；甲醇（
5、色谱 纯）购 于 美 国 默 克 公 司；磷 酸 氢 二 钠（）、磷酸二氢钾（）、氢氧化钠、浓盐酸购于广州西陇公司；叠氮化钠（）购于湖北鑫润德化工有限公司。仪器与设备 荧光分光光度计（日本日立有限公司）；精密电子天平（上海佳禾衡器有限公司）；真空冷冻干燥机（江苏天翎仪器有限公司）；冷场发射扫描电镜（日本日立有限公司）；电热恒温磁力搅拌水浴锅（江苏常州亿能仪器公司）；高速冷冻离心机（德国 公司）；激光衍射粒度分析仪（英国马尔文公司）。方法热处理 样品制备将 粉末溶于去离子水，分别置于 ，热处理 ，迅速冰浴冷却，冻干。热处理 复合物电位用含 叠氮化钠的 磷酸盐缓冲溶液（）（）配制（）的 溶液，室温
6、下磁力搅拌，储存备用。将 溶于 中配制成 的 水溶液，避光保存。按照质量比:将 溶液加入 溶液，室温下磁力搅拌 制成 热处理 复合物。参考 等 的方法测定样品的 电位。粒径测定参照 等 的方法测定制得样品的体积平均粒径（，）。微观样貌观察将 的冻干样品喷金上机，放大倍数为 倍。荧光光谱的测定参考 等 的方法稍作修改：逐次滴加 溶液（）于的热处理 溶液（）中，混合 ，记录体系的荧光光谱。激发波长 ，发射波长 ，激发和发射狭缝分别为和。数据统计与分析使用 和 软件绘图，软件进行显著性分析（）。结果与分析 与热处理 复合对 电位的影响 电位可以很好地表征颗粒之间的相互吸引能力，绝对值越低，粒子间存在
7、的斥力较小，易发生相互吸引而聚集；绝对值越高，粒子间的相互斥力第期冯思麟等：栀子苷与热处理大豆分离蛋白相互作用机理越大，越不容易发生相互碰撞和聚集的现象。由图可知，颗粒表面呈现出较低的负电性，且热处理前后基本不变（）。加入 后，电位绝对值均显著增大，可能是 自身携带电荷，或在中性条件下，与 结合掩盖后者的正电基团，使 的负电荷相对增加。此外，加入 后的复合体系中 热处理 的 电位绝对值最大，为（），这与代世成等 的研究结果相似，原因可能是 热处理使 的 球蛋白变性，改变了 空间构象，蛋白结构展开，增强了与 的相互作用，导致复合体系负电性增强。复合体系电位绝对值的增强说明 与 存在一定相互作用，
8、与 处理 所制的复合物的电位绝对值最大，稳定性最好。未处理80 60 100 SPIGE-热处理SPI复合物热处理条件0-5-10-15-20-25-30Zeta电位/mV图 及其复合物的 电位 与热处理 复合对粒径的影响从图可以看出，热处理与加入 均影响粒径的大小。未处理 的粒径为（），热处理后粒径分别降低至（），（），（），可能是由于热处理使 球蛋白和 球蛋白不同程度变性，一部分蛋白柔性结构展开，疏水基团暴露，乳化性增强，利于维持体系以小颗粒存在，所以体系蛋白颗粒的粒径随温度升高而逐渐减小。粒径/m未处理80 60 100 706050403020100SPIGE-热处理SPI复合物热处理
9、条件图 及其复合物的粒径 与热处理 形成复合体系后，粒径均显著低于未复合纯蛋白，说明 与热处理 之间存在相互作用，使颗粒向更小更稳定的趋势转变。不同 热处理 复合物相比，热处理 复合物体积平均直径最小，说明其稳定性最好。王忠江等 发现 中的 和 球蛋白的变性温度分别为 和。因此，热处理。会导致 的 球蛋白变性，导致 球蛋白结构展开进而促进 结构重排，形成空间结构更小更稳定的颗粒；处理后 球蛋白亦变性，空间结构变化导致热聚集作用，生成的大尺度聚集体阻碍了 与 的相互作用，粒径反而增大。表征图为不同热处理 及 热处理 复合物冻干样品 倍放大倍数下的电镜照片。从（、：未处理 、热处理 复合物，倍；和
10、、和、和、和分别为、热处理的 和 热处理 复合物，倍）。图热处理 及 热处理 复合物扫描电镜图 南昌大学学报（理科版）年图中可以看出，在冻干处理后，不同热处理 都是表面光滑无颗粒状物体存在的片状物，所有 热处理 复合物的光滑表面上均有不规则晶体状物质镶嵌在表面，这表明 与不同热处理 之间均有较好的相互作用。从扫描电镜图分析，热处理 结合的 数量较多，表明此时结合效果最好。荧光光谱 对热处理 内源荧光光谱的影响如图所示，不同热处理的 在 左右出现最大发射峰，随着 的添加量增加，不同热处理的 的内源荧光强度逐渐降低，表明 的加入会使不同热处理的 的内源荧光发生显著淬灭，二者发生了相互作用。此外，热
11、处理 的最大荧光发射波长均因淬灭剂 的加入发生了微小的红移，说明 和 的微观环境由疏水环境向亲水环境的转变，肽链结构发生扩展。此外，从图中荧光强度下降的程度可以看出，加入后，热处理 荧光下降程度最大。/nm/nm/nm/nm/nm/nm/nm/nm/nm/nm/nm/nm（：、温度下 未处理 荧光光谱；：、温度下 处理 荧光光谱；：、温度下 处理 荧光光谱；：、温度下 处理 荧光光谱）。图 对热处理 溶液内源荧光的影响 第期冯思麟等：栀子苷与热处理大豆分离蛋白相互作用机理（）未处理 （）处理 （）处理 （）处理 。图不同温度条件下的 淬灭热处理 的 图 与 相互作用的荧光淬灭机理使用 方程对荧
12、光光谱测定的数据进行分析。方程见公式。（）式中：和分别为未加入和加入淬灭剂 时 溶液的荧光强度；为动态淬灭常数；为栀子苷的浓度；为双分子淬灭速率常数；为淬灭剂不存在时荧光体的寿命，生物大分子的平均寿命约为 。根据图 曲线计算出 热处理 复合物的 和，结果见表。表不同温度下 热处理 复合物的 的相关参数 组别温度回归方程 （）（）未处理 处理 处理 处理 南昌大学学报（理科版）年从图和表发现，在种温度下 和热处理 的 曲线线性关系良好，表明只存在一种淬灭机制。对于动态淬灭而言，淬灭常数随着温度的升高而增大。静态淬灭则与其呈现相反的变化规律，即淬灭常数随着温度的升高而降低。且最大动态淬灭常数为 （
13、）。随着温度的升高，动态淬灭常数 呈现下降的趋势，且不同温度 与热处理 下的淬灭速率常数值都大于 （），因此 与热处理 的荧光淬灭机理属于静态淬灭方式。处理 与 结合的动态淬灭常数 最高，、和 的 分别为 、和 ，表明 处理 与 的荧光淬灭作用程度最大。而不同温度下 与热处理 的值均大于动态淬灭的最大动态淬灭常数，进一步说明 对热处理 的淬灭方式应主要是 与 中的荧光体结合形成非荧光的基态复合物引起的静态淬灭。同样能与其他小分子物质如姜黄素、没食子儿茶素没食子酸酯（）和甜菊糖苷 等发生静态淬灭。不同复合体系、不同物质之间值有差异，这可能同淬熄物与底物形成复合物后荧光基团的平动和转动分散速率有关
14、。与热处理 的表观结合常数和结合位点在静态淬灭过程中，可由双对数曲线方程计算结合常数和结合位点数：（）（）式中：为表观结合常数；为结合位点数。图为种温度下 与热处理 双对数曲线图，表为 和热处理 的表观结合常数和结合位点相关参数。（）未处理 （）处理 （）处理 （）处理 。图不同温度条件下的 淬灭热处理 的双对数曲线图 表中，与热处理 的结合位点约为，表明 与热处理 之间反应生成复合物的摩尔比约为。表观结合常数是衡量蛋白质与配体之间结合强弱的重要指标，表中远超个数量第期冯思麟等：栀子苷与热处理大豆分离蛋白相互作用机理级，说明 与热处理 的结合能力较强，复合物具有较好的稳定性。此外，通过比较的值
15、可以看出，未处理 与 具有更高的结合作用力，能形成更稳定的复合物。与热处理 的热力学参数与相互作用力的确定为判断 与热处理 之间的相互作用力类型，根据热力学方程计算热力学参数：（）（）式中：为吉布斯自由能变，为焓变，为熵变，为 表 观 结 合 常 数，是 理 想 气 体 常 数，为 （）。通过热力学方程计算 与热处理 相互作用的热力学参数焓变、熵变和吉布斯自由能变见表。由表可知，不同温度条件下 与热处理 相互作用过程中的吉布斯自由能变均小于，表明 和热处理 的结合是自发进行的。可以根据 和不同热处理 结合的热力学参数判断两者之间的相互作用力：当、均时，主要为氢键和范德华力；当、时，主要为静电相
16、互作用；当、时，主要为疏水和静电相互作用；当、均时，主要为疏水作用力。表中，和不同热处理 相互作用的、均小于，说明 和不同热处理 主要相互作用类型均为范德华力或者氢键。此外，不同温度热处理未改变 与 的相互作用类型。表 和热处理 的表观结合常数和结合位点 组别温度 （）未处理 处理 处理 处理 表 和热处理 的相互作用的热力学参数 组别温度（）（）（）未加热 处理 处理 处理 结论本实验探究了 与热处理 的相互作用力类型，结果表明，的加入会使 的 电位绝对值增大，颗粒平均直径变小。同时，处理 和 形成的复合物的 电位绝对值最大，体积平均直径最小。可通过静态淬灭方式淬灭热处理 的内源荧光，两种物质的相互作用剧烈，主要作用类型均为范德华力或者氢键，形成结合位点近似的复合物。不同温度热处理不改变 与 的相互作用类型。此外，处理 和 的结合力最强。综合上述粒径、电位及荧光等结果，可以确定 处理 和 具有最好的结合效果。本文结果可为开发栀子苷大豆分离蛋白复合物以提升栀子苷的生物利用度提供指导。参考文献：，南昌大学学报（理科版）年 ，：杨永安，谷江，张永春，等 京尼平对激素非依赖性前列腺癌裸鼠模型
