1、应，及维持完整神经网络进行病毒扩散，致病性狂犬病病毒的复制能力会低于弱毒株，在间接免疫荧光实验中，突变株 rC HL(GX074P48 78M)的病毒灶小于 rC HL 株，大于 GX074 及 CVS 11株;在多步生长曲线上，突变体病毒 rC HL(GX074P48 78M)的复制能力低于亲本弱毒株 rC HL，高于 GX074 株及 CVS 11 株。这可能与街毒株 GX074 株 P 蛋白 48 78 区域氨基酸协同 M蛋白影响了病毒突变株的复制能力有关。本实验为后续研究广西街毒株 GX074 株 P 蛋白对狂犬病病毒生物学特性的影响及筛选相关基因工程疫苗提供了理论基础。参考文献 1
2、Dodet，B，D N Durrheim and H ees，abies:underusedvaccines，unnecessary deathsJ Vaccine，2014 32(18):2017 2019 2 Albertini，A A，W uigrok and D Blondel，abies virustranscription and replication J Adv Virus es，2011 79:1 22 3 李忠，扈荣良 狂犬病发病机理的研究进展J 吉林畜牧兽医，2006(12):12 15 4 昝洁 狂犬病病毒基质蛋白诱导细胞凋亡、病毒粒子出芽和微管解聚的功能研究 D 浙江
3、大学，2016:145 5 Schnell，M J，T Mebatsion and K K Conzelmann，Infec-tious rabies viruses from cloned cDNA J EMBO J，1994，13(18):4195 4203 6Ito，N，et al，escue of rabies virus from cloned cDNAand identification of the pathogenicity related gene:glyco-protein gene is associated with virulence for adult mice J
4、 J Virol，2001 75(19):9121 9128 7 Inoue，K，et al，An improved method for recovering rabiesvirus from cloned cDNAJ J Virol Methods，2003，107(2):229 236 8Hosokawa Muto，J，et al，Characterization of recombi-nant rabies virus carrying double glycoprotein genesJ Microbiol Immunol，2006，50(3):187 196 9Xue，X，et a
5、l，Generation of recombinant rabies VirusCVS 11 expressing eGFP applied to the rapid virus neu-tralization test J Viruses，2014 6(4):1578 1589 10 Takayama Ito，M，et al，egion at amino acids 164 to303 of the rabies virus glycoprotein plays an important rolein pathogenicity for adult mice J J Neurovirol，2
6、004 10(2):131 135应用双抗体夹心 ELISA 检测罗非鱼感染无乳链球菌后组织和血清中抗原变化曾子轩，蒋薇，罗雨昕，陈汉忠*，王冬英*(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)中图分类号:S834 5文献标识码:B文章编号:1002 5235(2023)01 0007 06doi:10 3969/j issn 1002 5235 2023 01 002摘要:为了建立快速有效的罗非鱼无乳链球菌病早期诊断方法以便服务于及时疫情预警，试验通过双抗体夹心 ELISA 法确定罗非鱼不同组织(血液、脑、肝、头肾和脾)无乳链球菌阴/阳性临界值后，对感染无乳链球收稿日期:2022 04
7、 23基金项目:广西创新驱动发展专项资金项目(桂科 AA17204081 1);国家现代农业产业技术体系广西罗非鱼产业创新团队建设专项资金(nycytxgxcxtd 08 02 01)。作者简介:曾子轩(1993 )，男，硕士，研究生，研究方向为预防兽医学，498331883 qq com 为第一作者;蒋薇(1991 )，女，硕士，研究生，研究方向为预防兽医学，283732412 qq com，与曾子轩对本文具有同等贡献，并列为第一作者。*通讯作者。E-mail:chenhanz211 163 com;dywang gxu educn。菌不同感染剂量(50cfu/mL、100cfu/mL、20
8、0cfu/mL 和400cfu/mL)、不同感染时间(12 h、24 h、48 h、72 h、96h、120 h、144 h、168 h)罗非鱼的不同组织样品中的病原抗原进行检测。结果显示，双抗体夹心 ELISA 法确定脑、头肾、肝、脾及血清中抗原的阴/阳临界值分别为:0 192、0 198、0 196、0 173 和 0 163;感染后 12 h处理组脑组织 OD450值均显著高于对照组(P 0 01);除24 h 外感染组头肾组织 OD450值远大于对照组，且差异具有时间依赖性(P 0 01);感染后 24 h 肝组织OD450值达到峰值，96 h 恢复正常值;感染后 12 h，脾脏组织
9、OD450值显著高于对照组(P 0 05);感染后 12h血清 OD450值极显著高于对照组(P 0 01)，24 h 恢复正常，72 h 96 h 显著升高。研究表明，感染后 12 h，7广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)脑、头肾、脾及血清均能检出无乳链球菌抗原，表明双抗体夹心 ELISA 法检测敏感性好，适合罗非鱼无乳链球菌病的早期病原检测;脑、脾、头肾、肝、血清等均可作为检测无乳链球菌抗原的样本，但是感染后不同时间、不同组织的细菌含量可能不同，建议同时检测不同组织以确保结果更准确。关键词:罗非鱼;无乳链球菌;双抗体夹心 ELISA;抗原检测罗非鱼无乳链球菌病发病急、传播快、死亡
10、率高，特别是在疾病流行季节，鱼群一旦急性发病可能全军覆没1，2。在生产实践中，由于不能及时、准确诊断无乳链球菌病，给罗非鱼养殖业造成了惨重损失3 7。对于无乳链球菌病，应早发现、早治疗。因此，开发准确、快速的病原检测技术将是未来研究方向。目前，用于无乳链球菌检测的技术主要有常规检测技术和分子生物学检测技术，但这些检测技术一直停留在实验室研发阶段，未见成品上市8。另一方面，国内外针对罗非鱼无乳链球菌病的疫苗尚在实验室研究阶段，市场上未见商品化 疫苗9 11，使得广大养殖户对该病的防治只能依赖严格的生产管理和抗生素治疗。在此背景下，能否对罗非鱼链球菌病疫情进行快速、有效诊断就成为是否能成功遏制疾病
11、流行的关键因素，研发商品化无乳链球菌快速检测试剂盒已成为的迫切需求。因此，本研究采用浸泡感染方式建立了无乳链球菌接触感染罗非鱼模型，用本实验室前期已建立的双抗体夹心 ELISA 方法12 检测感染罗非鱼的血清及主要器官的抗原水平，研究罗非鱼感染无乳链球菌后其体内主要器官组织及血清中病原菌的分布变化规律，将有助于及时、有效的辅助诊断罗非鱼无乳链球菌病，为生产实践上防控罗非鱼链球菌病提供技术支撑。1材料与方法1 1菌种、实验鱼及饲养管理无乳链球菌 HN 株由广西大学动物科学技术学院寄生虫实验室鉴定、保存。吉富罗非鱼:每条40 5g，购自广西南宁罗非鱼良种场，每天上午 10点、下午6 点投喂人工配合
12、饲料，水温保持 20 25，全天供氧。1 2实验试剂抗罗非鱼无乳链球菌全菌抗原单克隆抗体3A9、酶标抗体 HP 4C12 由广西大学动物科学技术学院寄生虫实验室制备并保存。HP 羊抗鼠购于北京康为世纪公司。脱脂奶粉、PBS 磷酸盐缓冲液(pH 值 7 2 7 4)粉末、KH2PO4购于北京Solarbio 公司;TMB 购于美国 Sigma 公司;植物大豆蛋白胨、胰蛋白胨、细菌琼脂购于北京陆桥。1 3引物设计参照黎炯13 方法设计 CAMP 引物，由美国金唯智 公 司 合 成，引 物 序 列:上 游(P1):5AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT 3，下游(P2):5 CAGATAAT
13、CAAGCCCAGCAA 3。1 4细菌复苏培养及复壮14 1细菌复苏培养将实验室保存的无乳链球菌 HN 株无菌接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基，置于恒温振荡培养箱 37、200 rpm/min 培养 48h，6 000 rpm/min离心菌液 5 min，弃上清，用麦氏比浊管将菌液浓度调整到 1 5 109cfu/mL。14 2细菌复壮对 5 条(体重约 40g)健康吉富罗非鱼腹腔注射无乳链球菌(1 5 109cfu/mL)，0 01 mL/条，注射后置于 32 未流动的水中观察;在鱼表现拒食、眼凸、皮肤脱鳞、出血、泳姿异常等患病症状时及时采血;将采集的鱼血涂布于含5%兔血的 TSA(Trypca
14、sein Soy Agar，TSA)培养基，倒置于 37 恒温培养箱中培养，观察是否有疑似无乳链球菌菌落形成，并对其进行 PC 鉴定。反应体系和反应扩增参数分别见表 1 和表 2。表 1PC 反应扩增体系试剂体积(L)ddH2O12Taq Marster Mix9P1 引物(50pM)1P2 引物(50pM)1模板2共计25表 2PC 反应扩增参数反应类型循环数温度()时间(S)预变性194300变性退火延伸35944556457260再延伸172600保存Forever4Forever1 5感染实验将 175 条(平均约 40 g/条)罗非鱼随机分为 5组，35 条/组。根据不同感染强度，各
15、实验组分别饲养于含 50 cfu/mL、100 cfu/mL、200 cfu/mL 和8广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)400 cfu/mL 无乳链球菌的 50L 水族箱(长 60 cm 宽 45 cm 高55 cm)中，正常对照组饲养于不含无乳链球菌的水中，水温保持 32，7 天内不换水，不间断氧气供给。1 6样品采集和处理分别于感染后第 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h 从每个实验组随机捞取 4 条罗非鱼进行静脉采血、剖杀，采集脑、肝、头肾和脾等组织，采集区域表现眼观病变。鱼血置于 1 5 mL离心管中，常温析出血清后，1 0
16、00 g 离心收集血清，20 保存。分别称取(35 1)mg 脑、肝、头肾和脾组织块，每管加入0 5 mL 无菌生理盐水，用灭菌研钵制备组织匀浆，500 g 离心收集匀浆上清，20 保存。1 7双抗体夹心 ELISA 方法17 1样品制备取 10 条健康、无乳链球菌阴性罗非鱼进行条静脉采血、剖杀，采集脑、肝、头肾、脾等组织，血清及组织匀浆上清制备参照 1 4。1 7 2阴/阳性抗原临界值确定应用双抗体夹心 ELISA 方法对血清和组织匀浆上清进行检测，同时设置阳性对照和空白对照，每个样本设两个重复。按照阴/阳临界值=阴性 OD450平均值+3 标准方差求值，大于临界值判为阳性，否则判为阴性。1 7 3双抗体夹心 ELISA 具体操作方法用包被液稀释的单抗 3A9(10 24 g/mL)包被酶标板、洗涤 3 次，5min/次、5%脱脂奶粉封闭 2h，再洗涤后加入稀释样本，同时做复孔，37 反应1h。洗涤后加入 1 3 200 稀释的二抗 HP 4C12，37 反应1h。洗涤后加入 TMB H2O2显色液，37 避光显色时间。加入 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取 OD450
