1、今日畜牧兽医3源于白鹤球虫新种分子鉴定 王 艳1，张志忠2，徐前明2（1.合肥野生动物园 230031；2.安徽农业大学动物科技学院 230036 ）摘要：合肥野生动物园救助一例野生白鹤，在对该白鹤进行粪便检查时发现球虫卵囊，初步判定为艾美尔球虫；使用分子生物学的方法，根据 GenBank 中已发表的不同物种球虫的 ITS-1 基因（间隔转录区-1）序列采取同源性比对，取其保守区域设计特异性引物，建立白鹤球虫种的 PCR 鉴定方法，结果表示该方法可以从白鹤球虫卵囊样本中扩增出 539bp大小片段，与预期结果相同，同源性分析显示：该球虫分离株ITS1 基因与其他球虫毒株的核苷酸同源性都在 77
2、96之间，遗传进化树分析显示：所分离的白鹤球虫（Grane eimeria）和 Eimeria gruis 最接近，但不在一个分支上。由此可见，白鹤球虫与其他物种球虫不是同一种类，是一个新种。感染白鹤球虫种类较多，种类的确定有助于该病的预防和控制。关键词：白鹤；球虫；分子鉴定白鹤是濒危灭绝的动物之一，因其对环境适应能力较差,不能适应于人类经济活动导致的生存条件剧烈变化。因此,野外白鹤数量正在急剧减少。根据国际鹤类研究中心发布的数据,60 年代初期有几千只白鹤，而到了 1978 年全世界只剩下两百多只。国际生物学界认为白鹤濒临灭绝,将白鹤收录在 红皮书中作为警示。球虫病、血液原虫病是导致白鹤大批
3、死亡的主要疾病。我国禽类感染球虫较为常见，野生禽类也较为普遍，但白鹤发生该病较为少，白鹤球虫在国内外报道资料不为常见，累积资料较少，尚无详尽统计资料给予描述 ITS 基因在球虫虫种鉴定上的应用。本次对所分离的白鹤球虫进行鉴定，以便为白鹤球虫分类奠定基础。1 材料与方法1.1 病例来源采集粪便样品来自合肥野生动物园救助野生白鹤。1.2 细胞与载体提供自安徽农业大学动物科技学院寄生虫实验室的大肠杆菌 DH5；从 TaKaRa 公司购买的 pMD-19T 载体。1.3 主要仪器PCR 仪（AppliedBiosystems 公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；全自动凝胶成像分析仪（上
4、海培清科技公司，型号 JS680D）；DHP 恒温培养箱（上海实验仪器厂有限公司,型号 XMT-A7000）；冷冻高速离心机（赛默飞世尔科技）。1.4 主要试剂琼脂糖，SDS 和 Tris 碱（均购自北京鼎国生物技术有限公司）；BloodDNAkit（上海索莱宝生物科技有限公司）；胶回收试剂盒（QIAGEN 公司）；营养琼脂培养基（购自上海瑞楚生物科技有限公司）；普通肉汤（上海乔羽生物科技有限公司）；实验室提供的鲜血营养琼脂平板。PCR 扩增所用试剂：TaqDNA聚 合 酶、PCR 缓 冲 液、MgCl2、dNTPs、DNAMakerDL2000、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。姬姆萨染料（
5、购自Sigma公司）。2 方法2.1 PCR 扩增目的基因2.1.1球虫卵囊分离与纯化从合肥市野生动物园收集白鹤粪便，按照张龙乐等【2】报道的方法，采用饱和食盐水漂浮法进行球虫卵囊分离与纯化。2.1.2DNA 提取第一，将上述收集的 1105个球虫卵囊用玻璃珠打碎，加入 300L 细胞裂解液和 20L 蛋白酶 K 作用 4h，再向每管再加入酚和氯仿各 200L，小心颠倒混匀几下。13000rpm离心 13min。转移上清至新管。第二，加入 600L 氯仿：异戊醇(24:1)，震荡 10s，14000rpm离心 3min。第三，取上清液至新管，再向该 EP 管中加入 2 倍体积即200L 的无水
6、乙醇。第四，在-20的冰箱中冷冻保存 30min。13000rpm离心13min。丢弃上清。第五，加入 500 L 的 75%乙醇注入 EP 管中，轻轻地转上几下，清洗下 EP 管，然后去掉液体。第六，干燥箱内干燥 20min。第七，加入 30 L 的 TE 缓冲液，来回吹打几次即可，所提取的基因组用于 PCR 反应。2.1.3引物的设计根据 GenBank.U88565 用 Primer5.0 设计一对引物，预计扩增的片段为 539bp，引物由华大基因生物技术有限公司合成。2.1.4PCR 扩增目的基因取根据模板的编号进行相应编号的 EP 管按照下面的体系加样：mix（Taq 酶和 dNTP
7、）12.5l上下游引物 各 1lDNA 模板 1ldd 水 9.5lTotal 25lPCR 反应参数如下：预变性：945min；变性：9445s；退火：5630s；复性：7230s；进行 35 个循环，完成后在 72延长 10min，于 4下保存。2.1.5琼脂糖电泳检测 PCR 扩增产物将 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳（100V，40min）后，全自动凝胶成像仪分析并拍照。4xperimental study on onlineE实验研究2.2 PCR 产物的纯化按照回收试剂盒回收 PCR 产物。2.3 重组质粒 PMD19-T-ITS-1 的构建2.3.1 连接 PCR 产物与 T 载体
8、连接体系如下：PMD-19T1lSolution 5lDNA 回收片段 3lddH2O1l总体积10l短暂离心后于 4下保存过夜。2.3.2转化方法步骤如下：第一，10L 连接产物与 100L 感受态细胞混匀后，冰上作用 30min。第二，然后 42作用 90s。第三，加入 1LLB 培养基，180r/min 振荡培养 1h。第四，12000r/min 离心 20s，去掉800L，剩余的用涂棒均匀涂布在Amp平板上，放置10min后，倒置恒温培养 16h。2.3.3 阳性菌的克隆鉴定用灭菌的枪头从平板上挑取 4 个单菌落，置入灭菌的 LB培养基中培养（含 50g/mlAmp）至饱和。然后采用菌
9、落PCR 方法对其鉴定。2.3.4 基因的测序与比对将经 PCR 鉴定为阳性的克隆送至上海生物工程公司进行测序鉴定，测定的序列经 NCBI 中 Blast 工具进行序列比对，同时采用 DNAstar 软件对其抗原性进行分析。3 结果与分析3.1 卵囊分离结果图 1 白鹤球虫卵囊形态特征（400）将所得球虫进行孢子化试验（置入 2.5%重铬酸钾溶液，28），发现该球虫最早孢子化时间约为 23h。对其卵囊形态观察，其大小约为 16-18m8-12m，孢子化后 4 个孢子囊，每个孢子囊中含有 2 个子孢子。在外形上，一端窄，一端稍顿，无极孔和极冒等结构。初步判定属于艾美耳球虫属。3.2 PCR 扩增
10、目的基因结果用自行设计并由华大基因生物技术有限公司合成的一对引物，分别扩增该粪便基因组 DNA，得到 PCR 产物，将产物用 1%琼脂糖凝胶电泳后，参照 2000DNAMarker标记，在 500750bp 间出现一条 DNA 特异性条带，与预期在 539bp 相符，没有非特异性条带出现，扩增成功，琼脂糖凝胶电泳图：图 2 PCR 扩增结果M：2000bpMarker；2：阴性对照；3：PCR 扩增产物3.3 ITS-1 基因序列测定结果CGGcCAGTGcCAaGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-GATTTTGGTCAGGAAGTTACTTAAATAGAGCCCTCTAAAG-GA
11、TGCAAAACTCGTAACACGGTTTCCGTAGGTGAACCTGC-GGAAGGATCATTCACACTTGTTCGAAATGATAATGGAATG-GATCTTCCTTATCGATTTCGGATGATTTCCCACCGCATTGTAT-CAATCATTGAATCCGTGGCGTCTGCATGCATGGATTGGTGGC-CGGCCCATCCGTGCATACCAATGGGATCATATGGATATTCAC-CCCACAAAGGTTTCTCTTTTTTATTTAAAGCTTAACTACTACT-GCATATATACGGCGATTTGCGCAAAATGAGGAGCCGCATGC-GGGT
12、CGGCATGCAGCCCCGGGCAGTGGGGCATTGCACGGCG-GCGAGGATGTGACCTTGTGTCACTTCGCTCCCCGGGCAAACAT-CGTTATGAAATCGCGATCTATATACCCACGGGTATTATGTTG-TATGTTATTTTAAAAACTTTTTACAATGGATGTCTTGGCTCGT-GCAT所得基因经华大生物公司测序，所得序列长度为 539bp，其中 G+C 含量为 48.2%，A+T 含量为 51.8%。3.4 序列同源性分析将测序结果与 GenBank 中其他分离株基因序列进行了序列比对，结果发现，该分离株的基因与其他毒株的核苷酸同源性
13、均在 96以上，由绘制的进化树分析可知，该分离株与艾美球虫属（A 株）（登录号为 MF356556.1）亲缘关系最近，与其他分离株的核苷酸同源性为 77 96.3.5 ITS-1 基因遗传进化树分析图 3 所得基因遗传进化树分析结果由图 3 可知，采用 Mage 软件分析，运用最大简约法计算白鹤球虫（Graneeimeria）ITS-1 与所报道的 E.gruis 在遗传距离上最为接近，而与其他球虫不在同一分支上，且离隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum）遗传距离差距最大。4 讨论（后转第 7 页）今日畜牧兽医74.1 白鹤球虫种类鉴定根据临床资料及实验室检验结果，本园白鹤发生
14、的疫病主要为球虫感染所致。根据形态学鉴定，采用孢子化时间测定，卵囊指数和卵囊大小，外形特征和内部结构。所测的指数与鸡球虫均不完全相同，与孔雀球虫也不一致。与万雪、刘冰许等报道丹顶鹤球虫种类也不一致，他们发现丹顶鹤球虫大小为卵囊大小约为 18m16m，这种球虫宽度明显大于本次发现的球虫宽度，其外形是宽椭圆形，而本次发现白鹤球虫是长椭圆形3，4。采用分子生物学鉴定方法，根据 ITS-1 基因对其种类鉴定，这种方法以备广泛采用和实践，如辛玲等人采用该方法鉴定鸡球虫种类5。ITS-1 基因在不同种球虫是存在差异性的，是作为种类鉴定的理想靶分子基因，不同物种 ITS 基因差异是较大的，这样可以较好地区别
15、出不同种类球虫。本次扩增出 ITS-1 基因在同源性上，与已知柔嫩艾美耳球虫、火鸡球虫等差异性较大，同源性最高为 96%（但只是扩增 539bp 中的部分序列），部分同源性更低，只有 77%，初步说明本次白鹤球虫与已报道球虫 ITS-1 基因序列并不是同一序列，差异较大，可推测为它不同于其他球虫。在对作遗传进化树分析，发现其与所报道的 Eimeriagruis 在遗传距离上最为接近，而与其他球虫不在同一分支上，且离隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum）遗传距离差距最大。4.2球虫病的发生与环境卫生、饲养密度、气候、饲养管理、鹤鸟日龄大小等因素呈密切相关的。所以球虫病防治必须搞好
16、场地环境卫生，搞好舍内卫生制度，做好消毒措施，并保持笼舍干燥清洁，保持饮水和食物的干净清洁。营养条件是控制球虫病另外重要手段，应供给鹤群充足营养的饲料，补充足够维生素 A 和 C，发病时减少饲料中的钙含量等，对于球虫病控制也是十分必要的。一旦发生球虫病，除了药物，应给予鱼肝油配合治疗，提高疗效。参考文献1 张成林,刘燕,贾婷,等.中国鹤类动物发生疾病统计分析 J.野生动物,2012,3(6):245-349.2 张龙乐,徐前明,李培英.蓝孔雀球虫感染状况调查 J.中国家禽,2013,35(7):58-59.3 万雪.丹顶鹤球虫病的诊断与治疗仁 J.上海畜牧兽医通讯,2009(3):87.4 刘冰许.丹顶鹤和白枕鹤住白细胞虫病的防治 J.湖北畜牧兽医,1997(3):39-40.5 辛玲.三种鸡球虫 PCR 检测方法的建立及十株巨型艾美耳球虫 ITS-1 序列分析 D.扬州:扬州大学,2005 年硕士学位论文.6 陈浩,陈国运,李春荣,等.丹顶鹤球虫病的诊断与治疗 J.中国兽医寄生虫病,2007,15(2)：20-22.明，随着时间的推移和养殖规模的递增，单产水平逐渐增高，与增长速度呈正
