1、分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 747-753 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,747-753研究报告Research Report长春花茉莉酸受体 CrCOI1 的生物信息学分析与原核表达苗琪崔馨文周雅然于放王燕燕*大连工业大学生物工程学院,大连,116034*通信作者,wang_摘要通过生物信息学方法对长春花茉莉酸受体 CrCOI1 氨基酸序列、结构域以及二级、三级结构进行分析，利用分子生物学方法构建重组质粒并进行原核表达。结果显示：CrCOI1 编码 516 个氨基酸，为胞质定位，分子量为 58.26 kD，
2、等电点 pI 为 5.45，与番薯 COI1 蛋白的亲缘关系比较近，CrCOI1 含有 F-box 结构域、多个 LRR 富集亮氨酸重复结构域以及转运抑制响应 1 结构域；该蛋白二级结构由 50.97%-螺旋、31.59%无规则卷曲、12.79%延伸链以及少部分-转角(4.65%)组成；经 SWISS-MODEL 预测其三级结构显示，CrCOI1蛋白由-螺旋和无规则卷曲组成，其中 F-box 的 3 个-螺旋从蛋白的 N 端伸出便于结合配体。进一步地成功构建了重组表达质粒 pET28a-CrCOI1，并经 IPTG 诱导后在大肠杆菌 BL21 中实现异源表达，且发现经16、0.4 mmol/L
3、 IPTG 诱导至 12 h 后蛋白表达量最高，具有时间依赖性。上述结果表明，我们成功构建了长春花茉莉酸受体 CrCOI1 的重组表达质粒，实现大肠杆菌中的表达，并对其进行了序列以及结构分析。这为研究 CrCOI1 的功能以及通过其介导茉莉酸信号调控植物生长发育以及代谢产物合成提供一定依据。关键词长春花(Catharanthus roseus);茉莉酸受体 COI1;序列分析;结构预测;原核表达Bioinformatics Analysis and Prokaryotic Expression of Jasmonic AcidReceptor CrCOI1 from Catharanthus
4、roseusMiao QiCui XinwenZhou YaranYu FangWang Yanyan*School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,116034*Corresponding author,wang_DOI:10.13271/j.mpb.021.000747AbstractThe amino acid sequence,domain and secondaryand tertiarystructure ofjasmonic acid receptor CrCOI1were analyz
5、ed using the bioinformatics method.The recombinant plasmid was constructed using the molecularbiology method,and the prokaryotic expression was performed.The results demonstrated that the CrCOI1 encodes516 amino acids,molecular weight is 58.26 kD,and the isoelectric point pI is 5.45.Phylogenetic tre
6、e analysisrevealed that it was closely related to COI1 from Ipomoea batatas.The conserved domain analysis indicated thatCrCOI1 contained an F-box domain,a transport-inhibition response 1,and multiple LRR-enriched leucine repeatdomains.The secondary structure of the protein was composed of 50.97%-hel
7、ix,31.59%random coil,12.79%elongated chain,and a small part of-turn(4.65%).The results of tertiary structure prediction suggested thatCrCOI1 protein was surrounded by a helix and random coil on the outside and presented a pocket-like middle.Thethree-helices of F-box stretched out at the N segment,ma
8、king it convenient for binding ligand or other proteins.The recombinant expression plasmid pET28a-CrCOI1 was successfully constructed and heterologously expressedin Escherichia coli BL21 after induced by IPTG.It was discovered that the protein expression level after induction基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(3197
9、0324)和辽宁省教育厅基础研究项目(J2020042)共同资助引用格式：Miao Q.,Cui X.W.,Zhou Y.R.,Yu F.,and Wang Y.Y.,2023,Bioinformatics analysis and prokaryotic expression of jasmo-nic acid receptor CrCOI1 from Catharanthus roseus,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):747-753.(苗琪,崔馨文,周雅然,于放,王燕燕,2023,长春花茉莉酸受体 CrCOI1 的
10、生物信息学分析与原核表达,分子植物育种,21(3):747-753.)分子植物育种Molecular Plant Breedingat 16 and 0.4 mmol/L IPTG was performed for 12 h was higher,and the expression level was time-dependent.These results demonstrated that prokaryotic expression of the receptor CrCOI1 was realized and to achieve theexpression in E.coli,a
11、nd the sequence and structure analysis were carried out.This study provides a basis forstudying the function of CrCOI1 and regulating plant growth and development and metabolite synthesis through itsmediated jasmonic acid signaling.KeywordsCatharanthus roseu;JAreceptorCOI1;Sequenceanalysis;Structure
12、prediction;Prokaryoticexpression植物激素茉莉酸(JA)参与植物生长、代谢调控等很多生物进程，尤其在调节次生代谢产物合成中发挥重要作用，如尼古丁、萜类吲哚生物碱、花青素、青蒿素等(Shoji et al.,2010;Zhou and Memelink,2016;Wasternack and Strnad,2019)。因此，茉莉酸信号调控成为提高次生代谢产物积累的关键。COI1(CorOnatine Insensitive 1)蛋白冠素不敏感因子 1，是茉莉酸受体，是茉莉酸信号途径中重要信号元件(Yan etal.,2009)。COI1 属于 F-box 蛋白家族，
13、由于具有LRR(Leucine-rich repeat)等不同的蛋白结合区域，决定了其对相应底物蛋白结合能力，保障了泛素介导的蛋白质降解系统操作的准确性(许克恒等,2018;Yanetal.,2018)。COI1 与 S 期激酶相关蛋白 Skp-Cul-lin-F-box 类 E3 泛素连接酶形成复合物(SCFCOI1),SCFCOI1复合体能够与 JA 负调控因子，jasmine ZIM结构域(jasmonate ZIM-motif,JAZ)蛋白结合，而 JAZ蛋白 C 端 Jas 结构域有助于 COI1 与转录因子结合，直接调控下游靶基因或次级代谢(陈艳和任春梅,2011)。其中 JAZ
14、蛋白靶点与 Basic helix-loop-helix(bHLH)转录因子 MYC2 结合已被证实(Kazan andManners,2013)。进一步研究发现，茉莉酸异亮氨酸复合物(JA-Ile)的存在是 SCFCOI1与 JAZ 蛋白质的相互作用的必要前提(Yan et al.,2018)。在正常细胞中 JA含量很低时，JAZ 蛋白与 MYC2 蛋白形成复合物，并抑制 MYC2 蛋白转录激活下游靶基因；当 JA 浓度增加或外源信号刺激合成较多的 JA 时，由过氧化物酶体运输到细胞质中，在茉莉酸氨基酸合酶(JAR1)催化下形成茉莉酸-异亮氨酸复合物(JA-Ile)，随后JA 触发 JAZ
15、蛋白降解，释放结合的 MYC2(Yan etal.,2018)。MYC2 与 G-box 下游靶基因结合，开启特定的次级代谢通路，进而合成一系列次级代谢产物(Kazan and Manners,2013)。目前，很多植物中发现并证实 COI1 蛋白对植物代谢调控的关键作用，在药用植物中该基因还很少被克隆。长春花因其自身能够产生超过 130 种萜类吲哚生物碱，尤其仅在长春花植株中合成的长春碱和长春新碱在抗肿瘤治疗中具有重要应用价值(Zhouet al.,2009)，因此调控上述代谢产物具有重要意义。包括本实验室的前期研究发现，长春花茉莉酸受体 Cr-COI1 介导茉莉酸信号上调代谢途径关键酶基因
16、转录水平，进而调控长春质碱的积累(Vazquez-Flota et al.,2009;徐岩等,2017)，但对蛋白本身以及体外功能研究较少。本研究在实验室前期克隆 COI1 基因的基础上，通过生物信息学深入分析该蛋白的序列以及结构特点，并进一步构建原核表达重组质粒，诱导蛋白表达，为后续体外研究其结构与功能关系提供依据。1结果与分析1.1 CrCOI1的氨基酸序列分析与结构模拟本研究首先利用在线软件 ProtParam 对 CrCOI1编码的蛋白质进行理化性质分析，结果发现 CrCOI1编码分子量为 58.26 kD 的蛋白，等电点为 5.45，带正电荷的残基(Arg+Lys)总数为 58，带负电荷的残基(Asp+Glu)总数为 69，亲水性为-0.028，不稳定指数为47.59，初步确定 CrCOI1 蛋白为不稳定蛋白。CrCOI1 系统进化树分析结果显示，长春花与多种植物中的 COI1 均具有较高的同源性，尤其与番薯中 COI1 蛋白的亲缘关系比较近(图 1A)。进一步利用InterPro Scan 进行结构域分析，发现 CrCOI1 含有F-box 结构域，位于 1352aa，红色
