1、2023年第1期广西植保GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.1一种酶抑制-比色法农残速测试剂盒对多种农药的敏感性研究罗俊霞1，赵建波2，宋伟3，乔礼3，申战宾1，段鹿梅1（1.郑州市农产品质量检测流通中心河南郑州450006；2.郑州市农业技术推广中心河南郑州450006；3.河南省农产品质量安全检测中心河南郑州450002；）摘要：为了解市售酶抑制-比色法农残速测试剂盒对农药的敏感性，使其在农产品检测与监管工作中发挥更大的作用，研究采用日常检测工作中使用的泰扬品牌的酶抑制-比色法农残速测试剂盒，测定了其对27种农药的敏感性。结果表明，该试剂盒对各农药
2、的敏感性存在显著性差异，在所测定的27种农药中，试剂盒对喹硫磷、敌敌畏、丙溴磷、涕灭威亚砜等农药的敏感性较强，对倍硫磷、甲基对硫磷、蝇毒磷、氧化乐果4种农药的敏感性较差。酶抑制-比色法农药残留快速检测试剂盒对各种不同农药敏感性的巨大差异是引起该试剂盒检测结果假阳性、假阴性的原因之一，需要引起相关人员的重视。关键词：酶抑制-比色法；试剂盒；农药；抑制率；敏感性中图分类号：O656文献标志码：B文章编号：1003-8779（2023）01-0005-05酶抑制法农药残留检测技术是基于有机磷和氨基甲酸酯类农药对动物体内胆碱酯酶抑制作用而研制的1，该技术的检测结果表征的是有机磷和氨基甲酸酯类农药中一种
3、或者多种农药综合毒性2，因简便、经济而在全球得到普遍应用3，在我国的农产品质量安全监管工作中也扮演着重要角色。在日常检测工作中，其检测结果同样品的真实状况存在着一定的偏差，常有假阳性、假阴性的检测结果发生4，笔者认为试剂盒中的酶对农药的敏感性是导致其检测结果和样品真实状况发生偏差的因素之一，即酶对某农药的敏感性过高会导致检测结果产生假阳性，酶对某农药的敏感性过低会导致检测结果产生假阴性。酶对农药的敏感性是评价试剂盒质量的重要因素之一5，也是在日常检测工作中解决检测工作中所出现问题的关键，因此特安排本实验，采用在日常检测工作中所应用的试剂盒，测定了其对27种农药残留的敏感性，以期为使用者提供一定
4、的借鉴。1材料与方法1.1试验仪器农残速测仪（16通道、CL-BIII型，上海博纳新技术研究所、上海复博农业科技有限公司）；双重恒温水浴振荡器（SHA-C型，杰瑞尔电器有限公司）；漩涡混合器（WH-861型，上海精密仪器仪表有限公司）；电热恒温水浴锅（HH.W21-Cr 420型，北京三二八科学仪器有限公司）；Thermo 200 L的移液枪和Rongtai 5 mL。1.2试剂试剂盒湖北泰物生物科技有限公司试验用水：纯净水。使用前，缓冲盐用500 mL的纯净水溶解；酶和显色剂使用3 mL的缓冲溶液配制，底物用3mL的纯净水配制。收稿日期：2022-01-04基金项目：郑州市农产品质量检测流通
5、中心建设项目（豫发改农经20111778号）。作者简介：罗俊霞（1972-），女，高级农艺师，从事农产品安全品质的检测与研究。E-mail：。*通信作者：赵建波（1971-），男，推广研究员，主要从事工作或者研究方向。E-mail：。5广西植保2023年第1期GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.11.3农药品种的选择喹硫磷、敌敌畏、丙溴磷、敌百虫、对硫磷、久效磷、伏杀硫磷、水胺硫磷、二嗪磷、三唑磷、毒死蜱、马拉硫磷、杀扑磷、氧化乐果、蝇毒磷、甲基对硫磷、倍硫磷、乐果、甲拌磷、辛硫磷、甲基异柳磷、地虫磷22种有机磷类农药（Organophosphorus
6、 Pesticide，以下简称OP）和涕灭威、涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、克百威5种氨基甲酸酯类农药（Carbamate Pesti-cide，以下简称CP）。农药标准品来源于农业环境保护科研检测所，浓度为 1 000 mg/L，先稀释成 80 g/mL 的储备液，实验时按照需要进行吸取。1.4试验设计每一种农药分别设置5个浓度梯度，制备方法为：取适量农药标准品于一次性烧杯中，按照2 g称样量，使农药的质量分数为0.05、0.5、1、2、3 mg/kg，每个浓度水平3次重复。1.5测试方法对照液（缓冲溶液）和农药测试：对照液和农药的测试方法参照国标6进行；因为国标和行标7测试时样品提取液的取
7、用体积分别为2.5mL和3mL，因此本试验设定2.5 mL和3 mL两种样品提取体积。取10 mL一次性试管若干，分别移取2.5 mL和3 mL的对照液和样品提取液于其中，依次往其中加入100 L酶、100 L显色剂，旋涡混匀，在37条件下水浴10 min，之后加入100 L底物摇匀，将对照液放入16通道的CL-BIII型农残速测仪的第一通道比色池进行检测，通过仪器读出3 min内吸光度的变化；将处理后的农药样品依次放入前述农残速测仪的其他通道比色池中进行检测；通过仪器直接读出后面通道的抑制率并做记录。仪器根据第一通道测定的对照3 min内吸光度的变化值自动计算得到抑制率。1.6试验数据的处理
8、（1）选取5种农药在各浓度水平下3次测定所得抑制率的加权平均值在0100%之间的浓度值，用Excel将抑制率和农药浓度常用对数的散点图进行线性拟合，得到浓度-效应曲线方程，求出相关系数及每一种农药对各种试剂盒的半抑制浓度IC50。根据浓度效应曲线方程y=kx+b求得y=50%时对应的x轴的值，IC50=10 x；线性范围是抑制率为0的最大的浓度值到测定的最大的抑制率对应的浓度值之间的范围；同样求出IC10。因食品安全国家标准8中规定蔬菜中氧化乐果、甲胺磷、敌百虫的最大限量分别为 0.02、0.1、0.5 mg/kg，个别试剂盒测定这3种农药的IC50的最大值分别为824、3.84、1.8210
9、4mg/kg9-11，其对应的IC10的值分别为0.610、0.200、7.35 mg/kg9-11，均大于国家的限量标准，因此本试验将IC10设定为试剂盒的检测限，以此比较试剂盒对不同农药的敏感性；IC10越低，说明试剂盒对该农药越敏感。当IC1010-3mg/kg，试剂盒对农药极敏感；当10-3mg/kgIC1010-1mg/kg，试剂盒对农药较敏感；当10-1mg/kgIC101 mg/kg，试剂盒对农药不敏感。（2）通过（1）的结果比较2.5 mL和3 mL的样品提取体积对测定结果的影响和该试剂盒对不同的有机磷农药的敏感性。2结果与分析2.1泰扬试剂盒对27种农药的敏感性分析经过测定，
10、当样品提取液取用3 mL时，泰扬试剂盒中的酶对喹硫磷极敏感，当农药浓度为 0.05g/mL时，抑制率就达到了100%；对乐果、甲拌磷、甲基异柳磷、地虫磷4种OP极不敏感，在5个浓度水平下抑制率均为0；测定辛硫磷数据凌乱，不成线性。当提取液取用2.5 mL时，泰扬试剂盒中的酶对甲基异柳磷、地虫磷2种OP极不敏感，在5个浓度水平下抑制率均为0；测定在乐果、甲拌磷、辛硫磷的数据凌乱，不成线性。其他21或22种农药分别按照其IC10进行排序，见表1和表2。当提取液取用3 mL时，泰扬试剂盒对27种农药的敏感性按照喹硫磷、敌敌畏、丙溴磷、涕灭威亚砜、克百威、涕灭威砜、敌百虫、涕灭威、对硫磷、久效磷、伏杀
11、硫磷、水胺硫磷、二嗪磷、灭多威、三唑磷、毒死蜱、马拉硫磷、杀扑磷、氧化乐果、蝇毒磷、甲基对硫磷、倍硫磷的顺序依次降低。试剂盒对喹硫磷、敌敌畏、丙溴磷、涕灭威亚砜4种农药极为敏感，其IC10均在10-3mg/kg以下，占所测试农药总数的14.8%；试剂盒对克百威、涕灭威砜、敌百虫、涕灭威、对硫磷、久效磷、伏杀硫磷、水胺硫磷8 种农药较为敏感，其IC10均在10-310-1mg/kg之间，占所测试农药总数的29.6%；试剂盒对二嗪磷、灭多威、三唑磷、毒死蜱、马拉硫磷5种农药不太敏感，其IC10在10-11 mg/kg之 62023年第1期广西植保GUANGXI PLANT PROTECTION 2
12、023，Vol.36No.1间，占所测试农药总数的18.5%；试剂盒对杀扑磷、氧化乐果、蝇毒磷、甲基对硫磷、倍硫磷、乐果、甲拌磷、甲基异柳磷、地虫磷极不敏感，其IC101 mg/kg，占所测试农药总数的14.8%。表1提取液取用3 mL时试剂盒对21种农药的敏感性对照农药敌敌畏丙溴磷涕灭威亚砜克百威涕灭威砜敌百虫涕灭威对硫磷久效磷伏杀硫磷水胺硫磷二嗪磷灭多威三唑磷毒死蜱马拉硫磷杀扑磷氧化乐果蝇毒磷甲基对硫磷倍硫磷3 mL的提取液取用体积抑制率方程y=0.800 x+100.240y=2.172x+97.998y=5.431x+97.447y=39.633x+87.908y=41.985x+88
13、.810y=49.149x+97.160y=44.515x+84.462y=51.754x+85.188y=52.873x+83.950y=40.408x+48.398y=52.284x+64.315y=34.035x+43.348y=43.023x+51.108y=43.621x+50.768y=15.491x+21.893y=62.472x+0.430y=17.101x-0.989y=23.188x+6.759y=53.207x-2.700y=10.968x+3.992y=2.007x+1.911线性范围（mg/kg）0.050.50.053.00.053.00.053.00.053.00
14、.052.00.053.00.053.00.052.00.053.00.053.00.053.00.053.00.053.00.053.013.01.03.00.53.013.00.53.00.053.0R21.000 00.851 70.949 40.887 60.884 90.886 50.935 60.948 70.966 70.955 80.954 80.896 70.897 70.867 50.809 00.995 40.755 60.954 10.800 60.945 40.480 9IC50（mg/kg）1.580 010-638.044 510-231.732 310-90.1
15、10 50.119 00.100 00.168 20.209 00.228 00.065 30.532 41.568 20.942 40.960 365.222 91.002 71.221 873.248 77.952 41.566 01049.057 01023IC10（mg/kg）03.109 610-417.895 910-170.010 820.013 270.014 20.021 250.035 250.039 940.063 780.091 50.104 80.110 80.116 30.170 70.987 91.157 91.379 71.732 63.530 11.22810
16、8表2提取液取用2.5mL时试剂盒对22种农药的敏感性对照喹硫磷丙溴磷涕灭威亚砜二嗪磷敌敌畏敌百虫克百威涕灭威砜对硫磷y=2.000 x+100.600y=5.900 x+101.780y=6.082x+97.579y=12.058x+54.567y=0.700 x+100.210y=43.388x+91.168y=41.356x+87.143y=43.473x+87.924y=49.593x+84.5720.050.50.050.50.053.00.053.00.050.50.053.00.053.00.053.00.053.01.000 01.000 00.928 00.862 51.000 00.843 10.901 40.863 90.955 25.010 010-261.673 710-91.505 210-80.418 01.862 010-720.112 00.126 40.134 20.200 95.010 010-462.780 410-163.992 110-152.013 310-400.013 50.013 60.016 10.031 4农药2.5 mL的提取液
