1、广 东 化 工 2023 年 第 6 期 178 第 50 卷 总第 488 期 一种基于一种基于 G4/hemin 过氧化物模拟酶过氧化物模拟酶 快速降解罗丹明快速降解罗丹明 B 的方法的方法 王振涛1，许蓓蓓2，程晓宏3,4*(1南通市产品质量监督检验所，江苏 南通 226011；2南通市食品药品监督检验中心，江苏 南通 226006；3南通市疾病预防控制中心，江苏 南通 226007；4南通市食品危害因子分析重点实验室，江苏 南通 226011)摘 要目的：建立一种基于 G4/hemin 过氧化物模拟酶快速降解罗丹明 B 的方法。方法：重复的富含 G 碱基的结构单元的 DNA片段能形成堆
2、积的 G-四链体结构(G4)，分子内平行 G4-DNA 与氯化血红素室温孵育成强活性的过氧化物模拟酶。吸取罗丹明 B 溶液于具塞比色皿中，依次加入过氧化物模拟酶、过氧化氢溶液，以手摇方式进行降解反应。结果：加入过氧化氢 30 min 后，溶液的颜色由桃红色变为酒红色，通过罗丹明 B 标准曲线计算得至少 90%以上的罗丹明 B 染料已降解。结论：该方法具有成本较低，方法简便，稳定性和重复性良好等优点，可推广至环境中罗丹明 B 的快速降解。关键词G-四链体结构；氯化血红素；过氧化物模拟酶；罗丹明 B；环境 中图分类号TQ 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)06-0178-03 A
3、 Rapid Degradation of Rhodamine B Method Based on G4/hemin Mimetic Peroxidase Wang Zhentao1,Xu Beibei2,Cheng Xiaohong3,4*(1.Nantong Product Quality Supervision and Inspection Institute,Nantong 226011；2.Nantong Center for Food and Drug Control,Nantong 226006；3.Nantong Center for Disease Control and P
4、revention,Nantong 226007；4.Nantong Key Laboratory of Food Hazards,Nantong 226011,China)Abstract:Objective:To establish a rapid degradation of Rhodamine B method based on G4/hemin mimetic peroxidase.Methods:Repeated G-base-rich DNA fragments can form a stacked G-quadruplex structure(G4).Highly active
5、 peroxidases were formed by incubating intramolecular parallel G4-DNA with hemin at room temperature.Rhodamine B,mimetic peroxidase and hydrogen peroxide solutions were added into a cuvette with stopper successively and degradated with shaking hands.Results:The color of the solution changed from pin
6、k to wine red,after adding hydrogen peroxide 30 mins.At least 90%of Rhodamine B dye was degraded by Rhodamine B standard curve.Conclusion:The established method is simple,cheap,stable and repeative.It can be used to degradate Rhodamine B in environment.Keywords:G-quadruplex structure；hemin；mimetic p
7、eroxidase；Rhodamine B；environment 罗丹明 B 又称玫瑰红 B，是一种水溶性强的人工合成的三苯甲烷类碱性染料，是致癌物质。罗丹明 B 常用作实验室中细胞荧光染色剂、激光材料、染料等行业，常常存在于纺织印染，造纸印刷，油漆和皮革等行业废水之中。国内外罗丹明B 染料残留降解方法目前主要有化学方法如氧化分解1-4、光化学降解(主要是基于 Fenton 反应等产生 OH 自由基、TiO2光催化产生 OH 自由基)5-11等，物理方法如光照12-14、微波15、加热16等辅助的催化降解，合成材料17-18，生物方法19-21等。近年来对罗丹明 B 染料降解已成为研究热点。
8、天然酶具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊蛋白质，但是天然酶具有稳定性差、易失活、不易制备等缺点，使其在应用过程中受限。研究表明重复的富含 G 碱基的结构单元的 DNA 片段能形成堆积的 G-四链体结构(G4)，分子内平行G4 结构与hemin 形成复合物后具有较高的过氧化物酶活性22。本工作针对目前罗丹明 B 染料降解物理、化学等方法缺点，生物方法不足，现提供一种廉价易得、操作简单、快速高效的罗丹明 B 降解方法，可应用于环境中染料降解。1 试验部分试验部分 1.1 仪器与试剂 分光光度计(WFJ 7200，苏州赛恩斯公司)，圆二色谱仪(Jasco J-815，Japan)，电
9、子分析天平(CPA 225D，德国赛多利斯公司)，数显恒温水浴锅(HH-2，国华仪器制造有限公司)，超纯水机(Milli-Q，密理博上海公司)。离心机(MIKRO 220R，德国 Hettich 公司)。30%H2O2、NaCl、KCl、HCl、Tris(三羟基氨基甲烷)、二甲基亚砜、底物 ABTS(2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)、Triton X-100 表面活性剂均为分析纯。实验用二级纯水由 Millipore 纯水仪制备。分子内平行结构G4-DNA：c-Myc 序列为 5-TGAG3TG4AG3TG4A2-3。1.2 溶液的配置 1.2.1 缓冲溶液的配
10、制 称取1.2114 g Tris、0.7455 g KCl、2.925 g NaCl于1 L烧杯中，加入800 mL水溶解后，用稀盐酸调节pH至7.5，得到缓冲液为20 mmol/L pH 7.5 Tris/HCl，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，0.05%Triton X-100。1.2.2 G4-DNA 溶液的配制 将分子内平行 G4-DNA 用缓冲液溶解，并在 95 下加热10 min，冷却至室温，4 静置过夜，备用，其浓度为 10 mol/L。1.2.3 氯化血红素 hemin 溶液的配制 hemin 用二甲基亚砜溶解，将 hemin 工作液用缓冲液稀释成
11、合适的氯化血红素 hemin 溶液，备用，其浓度为 20 mol/L。1.2.4 过氧化物模拟酶的构建 将上述 1.2.2 中的 G4-DNA 溶液与 1.2.3 中的氯化血红素hemin 溶液等体积混合，室温孵育 2 h，得过氧化物模拟酶。1.2.5 过氧化氢溶液配制 取质量分数为 30%的过氧化氢溶液，用纯水将其稀释至合适浓度备用。1.3 圆二色谱试验 圆二色谱在 400 L 1 cm 比色皿中扫描收集 220320 nm范围内的圆二色谱(500 nmmin-1)。DNA 的浓度为 4 M，DNA与 hemin 的浓度比为 21。为了便于比较，所得的圆二色谱均为扣除背景、平滑处理、浓度校准
12、后结果。1.4 罗丹明 B 标准曲线的绘制 收稿日期 2022-09-22 基金项目 江苏省南通市第六期江海英才市级培养专项第三层次；南通市科技计划项目(JC2020108)作者简介 王振涛(1982-)，男，江苏徐州人，工程师，主要从事食品检验。*为通讯作者。2023 年 第 6 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 488 期 179 图图 1 罗丹明罗丹明 B 的标准曲线的标准曲线 Fig.1 Standard curve of Rhodamine B 取 100 mg/L 罗丹明 B 储备液用纯水溶解，再用纯水稀释至所需浓。用紫外-可见分光光度计采集 1.25 中罗丹明 B 标准溶液
13、系列(1、2、5、7.5、10 mg/L)的光谱扫描(220800 nm)，发现罗丹明 B 最大吸收波长为 555 nm(图 1A)，绘制浓度与吸光度的响应曲线(图 1B)，线性回归方程为 y=0.2373x+0.1575，相关系数 r2=0.998。1.5 罗丹明 B 染料的降解反应 吸取 2.67 mL 20 mg/L 罗丹明 B 于 1cm 比色皿中，按照顺序依次加入 300 L 10 mol/L c-Myc/hemin 过氧化物模拟酶、30 L 100 mmol/L 过氧化氢，记录下这些过程中的最大吸收波长下吸光度；盖上比色皿盖子后，手摇比色皿，每隔 4 min 记录下最大吸收波长下吸
14、光度。将记录下的最大吸收波长下吸光度代入上述步骤 1.4 产生的线性回归方程，计算得未降解的罗丹明 B 浓度，进而计算出罗丹明 B 的降解率，并做只加c-Myc/hemin 过氧化物模拟酶和只加过氧化氢的降解对照试验。降解率=(A0-A)/A0100%。式中，A0和 A 分别为罗丹明B 降解前、后溶液的吸光度值。2 结果与讨论结果与讨论 2.1 圆二色谱图谱 众所周知，G-四链体结构呈现的圆二色谱CD信号取决于链的方向：平行G-四链体结构具有264 nm左右的正峰和240 nm左右的负峰23。从图 2，可以看出 c-Myc 在缓冲液中以平行结构；当加入 hemin 后，c-Myc/hemin
15、仍为分子内平行结构。而作者之前报道过分子内平行结构的 G4-DNA 具有很强的过氧化物酶活性22，为建立快速降解罗丹明 B 提供了理论依据。图图 2 G4 及及 G4/hemin 复合物的复合物的 CD 光谱光谱(DNA 浓度为浓度为 4 M)Fig.2 CD spectrum of G4and G4/hemin complex(DNA concentration was 4 M)2.2 罗丹明 B 的降解条件的优化 2.2.1 pH 值的选择 罗丹明 B 的主要降解方法氧化分解、光化学降解等往往在酸性条件下产生 OH 自由基等强氧化活性物质进行降解，而本工作中使用的 G4/hemin 过氧化
16、物模拟酶的活性机制与经典光催化反应不同(Fenton 反应等产生 OH 自由基、TiO2光催化产生 OH 自由基)。以往文献报道 G4/hemin 模拟酶的活性在弱碱性条件下，过氧化物酶活性较高22-25。过氧化物模拟酶活性直接决定了罗丹明 B 染料的降解效率，我们优选结构稳定的、活性较强的G4-DNA(c-Myc 为人的 c-myc 抑癌基因片段)22用于罗丹明 B染料的降解，其最近 pH 条件为弱碱性(pH 78)。因此，我们选择接近人体液弱碱性 pH 值 7.5 用于降解反应。2.2.2 温度的选择 物理方法如光照12-14、微波15、加热16等物理辅助手段能加快罗丹明 B 染料的催化降解，但是往往回导致实验的复杂性、实验成本增加等问题。以前文献22-25曾报道分子内平行的 G4/hemin 在常温常压下具有较强的过氧化物酶活性。为了简化降解反应程序、削减实验成本，依然选择在室温下进行罗丹明 B 的降解。2.2.3 G4/hemin 过氧化物模拟酶浓度的选择 1.2.4 中过氧化物模拟酶浓度为 5 mol/L，以常规的 1 cm比色皿为降解反应池，较合适的总体积为 3 mL 左右
