1、的问题.首都医药，（下）：.罗剑，张敏，周琳婷，等.细胞宿主蛋白含量双抗夹心法 检测方法的建立.微生物学免疫学进展，（）：.张峰，董衍东，郭莎，等.种中国仓鼠卵巢细胞蛋白残留检测试剂盒的比较研究.中国药学杂志，（）：.张峰，秦俭，郭莎，等.宿主细胞蛋白残留量检测方法适用性验证.中国药学杂志，（）：.，.：.，（）：.，.，（）：.王宁，佟雪莲，边静雅，等.昆虫细胞宿主蛋白含量双抗夹心 检测方法的建立.中国生物制品学杂志，（）：.支文标，李巍巍，李士杭，等.补料优化降低生产过程中宿主细胞蛋白残留的研究.现代生物医学进展，（）：.，.，：.，.（）.，（）：.，.，.，（）：.柯志，周冬梅，徐军，
2、等.单抗制品中 细胞宿主蛋白双抗夹心 检测方法的建立.中国生物制品学杂志，（）：.，.，（）：.赵玉秀，梁宏阳，马可，等.鸡胚细胞疫苗制品宿主细胞残留量检测方法的建立.中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会，.，.，（）：.，.（）.，：.，.（）.，（）：.驯化台湾香檬中川陈皮素与辛弗林的鉴别与测定王 杰（福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建厦门）摘要：目的 建立驯化台湾香檬中川陈皮素与辛弗林的鉴别和测定方法。方法 采用薄层色谱法进行定性鉴别，高效液相色谱法进行含量测定。色谱条件 色谱柱（.，.）；流动相（乙腈）流动相（十二烷基硫酸钠.，冰醋酸，乙腈，加
3、水定容至）等度洗脱；流速为；检测波长（辛弗林）、（川陈皮素）；柱温 。结果 薄层色谱中供试品与对照品相应位置斑点一致。川陈皮素、辛弗林线性范分别为.（.）、.（.）。加样回收率分别为.（.），.（.）。精密度、重现性、稳定性良好。结论 所建立的方法专属性强，灵敏、可靠，可用于川陈皮素与辛弗林的鉴别与测定。关键词：台湾香檬；川陈皮素；辛弗林；薄层色谱法；高效液相色谱法中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：王 杰，男（）。学历：硕士研究生。职称：工程师。从事植物天然产物产品研发。基金项目：厦门市重大科技计划项目（.）（，）海峡药学 年 第 卷 第 期：.，：（.，.）；，（.，）；：；：
4、，：.，（）.，.，.，.，.，.：；台湾香檬 是芸香科柑橘属多年生植物，又名扁食柠檬、山桔仔，日本人又名，是台湾和日本地区常见的药食同源植物，因日本冲绳长寿村的名气享誉世界。现代化学与药理学研究表明台湾香檬主要含有川陈皮素、橘皮素、辛弗林及维生素、维生素 等成分，具有抗氧化，、抗肿瘤、抗炎等保健医疗作用，开发利用价值高，是一种经济效益较好的果树品种。川陈皮素（，）又称蜜橘黄酮、川皮亭等，是从柑桔属植物果皮中提取的多甲氧基黄酮类化合物，具有广谱抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性。川陈皮素主要从柑橘、茶枝柑等果皮中提取分离制备，也可用桔皮素等黄酮物质为母本化学合成，但受制于原材料含量、成本等尚无法大量
5、获得，限制了川陈皮素的进一步药用和食用研究。辛弗林（）又名对羟福林、交感醇、脱氧肾上腺素，存在于芸香科柑橘属植物中，其中以酸橙幼果中含量最高，是枳实提取物的主要活性成分。辛弗林的药理作用表现为使肾上腺素 受体和心脏 受体兴奋，能加速人体的新陈代谢和促进食欲。鉴于台湾香檬的价值，年 月福建省亚热带植物研究所从台湾屏东地区引进台湾香檬，引进植株为一年生袋装嫁接苗，砧木为酸橙，初步规模 株。经扦插扩繁后，现有驯化台湾香檬约 株，于 年 月移植落地，目前植株约.米高，当年挂果，植株进入成熟期。本研究旨在于验证驯化后台湾香檬中川陈皮素和辛弗林的物质积累情况，为台湾香檬的开发利用提供理论依据。图 川陈皮素
6、分子结构式图 辛弗林分子结构式 材料.材料与试剂 材料：台湾香檬采收自福建省亚热带植物研究所台湾香檬苗圃，烘干，粉碎至粗粉，备用。主要仪器：高效液相色谱仪（检测器）、电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、四用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）、电热恒温水浴锅（国华仪器制造有限公司）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、多功能粉碎机（河城工贸有限公司）、精密鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、旋转蒸发仪（日本）、号标准药典筛等。主要试剂：川陈皮素对照品（批号：.，），购自北京索莱宝科技有限公司；辛弗林对照 品（批 号：.，），购自北京索莱宝科技有限
7、公司；乙腈 色谱纯 安可化工；其他试剂均为分析纯；超纯水为实验室制备。.研究方法.川陈皮素 鉴别：精密称取台湾香檬果皮粉末.，置于 三角瓶中，加入 甲醇，超声提取，提取 次，过滤，置于 蒸发皿中蒸干，溶解并定容至 ，作为供试品溶液。另取川陈皮素对照品，加甲醇制成每 含.的溶液，作为川陈皮素对照品溶液。吸取对照品、供试品溶液各 ，分别点于同一硅胶 薄层板上，以正己烷乙酸乙酯甲醇（）为展开剂，展开约，取出，晾干，喷以 三氯化铝试液，置于紫外灯（）下验视。.辛弗林 鉴别：取台湾香檬果皮粉末.，分别 .置于 三角瓶中，加甲醇 ，超声处理 ，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至 ，作为供试品溶液。另取
8、辛弗林对照品，加甲醇制成每 含.的溶液，作为辛弗林对照品溶液。照薄层色谱法（通则）试验，吸取上述两种溶液各 ，分别点于同一硅胶 薄层板上，以正丁醇冰醋酸水（）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以.茚三酮乙醇溶液，在 加热至斑点显色清晰。.测定川陈皮素和辛弗林含量.色谱条件：色谱柱：（.，.）；流速：；柱温：；进样量：；检测波长：辛弗林为 ，川陈皮素为 ；流动相（乙腈）：流动相（十二烷基硫酸钠.，冰醋酸 ，乙腈，加水定容至 ）等度洗脱。.对照品溶液的配制：精密称取辛弗林对照品.，置于 量瓶中，加 甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为.的辛弗林对照品储备液。精密称取川陈皮素对照品.，置
9、于 量瓶中，加 甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为.的川陈皮素对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各 ，置同一 量瓶中，加 甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，每 含辛弗林.，川陈皮素.，冷藏，备用。.供试品溶液的制备：分别取台湾香檬果皮粗粉.，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入 甲醇 ，加热回流 ，补足减失重量，摇匀，滤纸滤过，滤液用.微孔滤膜过滤，取续滤液即得。.线性与范围：按“.”项下色谱条件分别进样、和 ，记录峰面积，以峰面积（，）进样量（，）进行线性回归。.方法学评价：按照“.”色谱条件，进行精密度、稳定性、重现性、加样回收率等方法学考察。.台湾香檬各部位川陈皮素和辛弗
10、林含量测定：取台湾香檬的根、茎、叶、果皮，平行称定 份。按“.”项下供试品制备方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液，按“.”项下色谱条件进行含量测定，根据相应标准曲线计算样品中含量。结果.定性鉴别.川陈皮素 鉴别：结果显示，供试品色谱中，值.范围内有 个荧光斑点，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（见图）。.辛弗林 鉴别：结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（见图）。.测定川陈皮素和辛弗林含量.线性与范围：川陈皮素回归方程 .，.。辛弗林 .，.。测定结果表明：川陈皮素在.范围内，辛弗林在.范围内线性良好。图 川陈皮素薄层鉴别色谱图、：供试品溶液；、
11、：川陈皮素对照品图 辛弗林薄层鉴别色谱图、：供试品溶液，、：辛弗林对照品图 混合对照品 色谱图辛弗林.；川陈皮素.图 台湾香檬果皮提取液 色谱图辛弗林.；川陈皮素.精密度实验：取“.”项下混合对照品溶液，按照“.”项下色谱条件连续进样 次，记录峰面积。结果峰面积的 川陈皮素.，辛弗林为.，仪器精密度良好。海峡药学 年 第 卷 第 期.重现性试验：按照“.”项下供试品制备方法平行制备 份台湾香檬果皮供试品溶液，按照“.”项下色谱条件进行含量测定，计算各成分含量。结果川陈皮素和辛弗林平均含量.（.）、.（.），表明方法重现性好。.稳定性试验：取同一台湾香檬果皮供试品溶液，室温放置，在 、不同时间段
12、，每个时间段按照“.”项下色谱条件进行含量测定，记录峰面积。结果峰面积的 川陈皮素.，辛弗林为.，表明样品稳定性良好。.加样回收率试验：取已知含量的台湾香檬果皮 份，每份精密称取.，加入配置好的川陈皮素对照品储备液、辛弗林对照品储备液.，精密移取 甲醇.，按照“.”项下供试品制备方法制备台湾香檬果皮供试品溶液，按照“.”项下色谱条件进行含量测定，记录峰面积并计算回收率。结果川陈皮素平均加样回收率为.，.，辛弗林平均加样回收率为.，.，表明加样回收率良好（见表）。表 加样回收率试验结果（）成分样品中含量（）对照品加入量（）测得量（）回收率（）平均值（）值（）川陈皮素.辛弗林.表 样品含量测定结果
13、（）药用部位样品量（）川陈皮素峰面积（）辛弗林峰面积（）川陈皮素含量（）辛弗林含量（）果皮.根.茎.叶.样品含量测定：按照“.”项下供试品制备方法平行制备 份台湾香檬根、茎、叶、果皮供试品溶液，按照“.”项下色谱条件进行含量测定，记录峰面积，计算样品中川陈皮素与辛弗林的含量，结果取平均值（见表）。测得各部位川陈皮素与辛弗林含量如下：川陈皮素测定结果：果皮为.，叶为.，茎为.，根为 ；辛弗林测定结果：叶为.，茎为.，果皮为.，根为 。讨论.随着驯化年限的增加，所引种台湾香檬果皮中川陈皮素的含量已经提高，并且超过了赖瑞云等报道的台湾原产地含量.。说明台湾香檬更适合厦门地区气候条件，有效成分含量提高
14、。根和文献报道的种子中川陈皮素含量为，推测植株内川陈皮素的合成途径应于光照因素有关。.辛弗林的含量叶片最高，茎次之，果皮较低，与川陈皮素的含量分布有差异，提示后续开发过程可以针对目标产物进行使用部位的选择。由于目前无法取得台湾地区材料，故无法研究辛弗林的含量对比，留待以后进一步研究。.提取溶媒考察了 甲醇、甲醇、甲醇、乙醇、乙醇、无水乙醇等不同溶剂，发现使用 甲醇作为溶剂时，提取效率高。.经过紫外扫描川陈皮素最大吸收波长在 和。条件下川陈皮素峰面积约为 的三分之二，吸收值较大，但是通过计算比较，发现两个波长条件下川陈皮素的测得含量有细微差异，为提高检测准确性同时考虑峰形对称等因素，川陈皮素的检
15、测波长选择 。如果液相条件不能满足多波长，可以考虑在 波长条件下同时测定辛弗林和川陈皮素。.辛弗林属于生物碱类物质，极性较强，在一般液相条件下呈现极弱的保留，经查阅文献发现，流动相中加入.十二烷基硫酸钠可以使保留时间延后，并且不影响川陈皮素的分离。不足之处在于十二烷基硫酸钠的加入容易导致系统平衡时间延长，同时其与 结合能力较强，容易损伤色谱柱，减少色谱柱使用寿命，所以检测过程中不宜梯度洗脱，防止流动相在线混合产生气泡影响检测结果和色谱柱寿命，检测后需要用 纯化水冲洗色谱柱至少 ，保证色谱柱中十二烷基硫酸钠清洗完全。其次十二烷基硫酸钠的纯度对色谱柱寿命亦有影响，本实验所用十二烷基硫酸钠为分析纯，
16、多次实验后色谱柱未见分离度降低的现象，如有可能十二烷基硫酸钠尽量使用色谱纯级。参考文献林书妍，陈右人.台湾原生柑橘之研究及其利用现况.植物种苗，（）：.：.，（）：.，.，（）：.翟培，韩晋辉.扁食柠檬汁抗氧化活性及其对冷鲜肉保鲜效果的研究.保鲜研究，（）：.蔡秉昌，赖宏亮.台湾香檬果皮成分分析、抗氧化及抑制氧化氮活性之研究.作物、环境与生物资讯，（）：.谷乐，刘韶松，何丽娟，等.台湾香檬果皮川陈皮素分离制备及其抗肿瘤活性研究.亚热带植物科学，（）：.侯春宁，张雪松，李国林.川陈皮素对口腔鳞状细胞癌细胞 增殖、迁移和侵袭的影响.口腔医学，（）：.张阳，姜华茂.川陈皮素对人前列腺癌 细胞生长的抑制作用及其机制.吉林大学学报（医学版），（）：.，.，（）：.，.，.，（）：.，.，（）.，：.，.（）.，：.，.，（）.梁奕尧，陈柏忠，杨玉华，等.中国药典 版陈皮质量标准修订的研究.中国医院药学杂志，（）：.赖瑞云，黄珺梅，林建忠，等.台湾香檬在厦门地区的引种初报.亚热带植物科学，（）：.承晨，李莉.法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量.药学与临床研究，（）：.法同时快
