1、2022年（第42卷）第11期Vol.42,No.11,62-71,2022体 育 科 学CHINACHINA SPORTSPORT SCIENCESCIENCE外源性agomir-133在跑台运动改善心脏病理性重塑中的作用邢正，陈雪飞，张玉寒，张靖博，张靓*（北京师范大学 体育与运动学院，北京 100089）摘要：目的：在腹主动脉缩窄（abdominal aortic coarctation，AAC）诱导的心脏病理性重塑大鼠模型上，观察运动对内源性miR-133表达的调节作用；通过外源性给予agomir-133后，观察运动对心脏病理性重塑及心肌凋亡的影响，探讨miR-133在跑台运动改善心脏
2、病理性重塑中的作用及可能机制。方法：SD大鼠随机分为4组：假手术组（CON组）、腹主动脉缩窄组（AAC组）、腹主动脉缩窄跑台运动agomir-NC给药组（AENC组）以及腹主动脉缩窄跑台运动agomir-133给药组（AEagomir-133组）。术后4周，AENC组和AEagomir-133组大鼠开始进行为期4周的跑台运动，并分别给予agomir-NC和agomir-133。末次训练后采用超声心动检测心功能。苏木素-伊红染色观察心肌和腓肠肌形态；天狼星红染色观察心肌纤维化；TUNEL检测心肌细胞凋亡；ELISA法检测血浆中肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）浓度；Real-time
3、 PCR检测血浆和心肌中miR-133表达、心肌心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和MSTN的表达、型胶原蛋白（collagen）和型胶原蛋白（collagen）的表达以及凋亡相关基因Bcl2相关X基因（Bcl2-Associated X，Bax）和B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表达。结果：AAC组大鼠发生心脏病理性重塑，心功能有所降低，心肌出现肥大，心肌细胞横截面积增大、纤维化和凋亡增加，心肌miR-133表达降低而血浆表达水平升高；4周跑台
4、运动后心脏病理性重塑得到改善，心功能恢复，心肌肥大得到改善，心肌细胞横截面积降低、纤维化和凋亡减少，心肌miR-133表达升高而血浆表达降低；agomir-133给予后，运动改善大鼠心脏病理重塑的作用被抵消，心功能有所下降，心肌出现肥大，心肌纤维化和凋亡增多，骨骼肌出现明显萎缩。结论：跑台运动能够显著改善心肌肥大和纤维化，抑制心肌细胞凋亡，同时增加心肌miR-133表达，降低循环中miR-133水平；外源性的agomir-133给药抵消了运动对心脏病理性重塑的改善和抗凋亡效应，其作用可能与外周机制相关。关键词：跑台运动；心脏病理性重塑；腹主动脉缩窄；微小核糖核酸-133中图分类号：G804.2
5、 文献标识码：AmiR-133由Chen等（2006）在 自然 杂志（Nature）上首次报道发现，并证实其在成年人心肌和骨骼肌组织中特异性的高表达，被称为肌源性 miRNA（myo-miR）。miR-133在肌肉的增殖分化、细胞凋亡、血管生成、脂肪组织褐色化等过程中发挥重要的生物学作用，广泛参与多种疾病的病理生理过程。有研究提示，miR-133与心肌肥大、心肌梗死和心衰等多种心脏疾病的发生和发展密切相关。在人和动物模型中均观察到病理性心脏重塑以及心肌肥大时，心肌miR-133的表达水平显著降低。当心脏重塑发展成心力衰竭后，有临床研究表明心肌中miR-133a的表达水平与心衰的严重程度呈反比（
6、Danowski et al.，2013）。miR-133 可通过抑制其靶蛋白 ras同源物家族成员 A（ras homolog family member A，RhoA）、细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42）和活化 T 细胞核因子 c4（nuclear factor c4 of activated T cells，NFATc4）等表达，发挥强大的抑制心肌肥大的作用（Li et al.，2010）。miR-133 还能通过抑制结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）（Duisters et al.，
7、2009）、锌指转录因子 Snail（zinc finger transcription factor snail）（Muraoka et al.，2014）、型胶原 A1（collagen A1，Col1A1）（Castoldi et al.，2012）和 转 化 生 长 因 子-1（transforming growth factor-1，TGF-1）（Shan et al.，2009）的表达进而抑制心肌纤维化，改善心脏重塑。miR-133 抑制心肌细胞凋亡是其发挥心肌保护作用的主要机制。Xu等（2007）研究证实 miR-133 能够使大鼠 H9c2 心室细胞凋亡基因天冬氨酸特异性半胱氨
8、酸蛋白酶 9（Cysteinyl as文章编号:1000-677X(2022)11-0062-10DOI:10.16469/j.css.202211008收稿日期：2021-12-30；修订日期：2022-10-03基金项目：国家自然科学基金面上项目（31871207）。第一作者简介：邢正（1996-），男，在读博士研究生，主要研究方向为运动生物化学与代谢性疾病，E-mail：202231070009 。*通信作者简介：张靓（1976-），女，教授，博士研究生导师，主要研究方向为运动生物化学、运动与代谢调控，E-mail：zhangjing 。62邢正，等：外源性agomir-133在跑台运动
9、改善心脏病理性重塑中的作用partate specific protease-9，Caspase-9）的总蛋白水平降低89%，降低基础 Caspase-9 的活性，阻止了氧化应激诱导的Caspase-9 活性的增加，并通过抑制 Caspase-9 间接下调Caspase-3 活性，提高了细胞活力和生存能力，抑制细胞凋亡的发生。长期规律的有氧运动能够有效降低心血管疾病的发病率，减轻疾病症状，对心血管疾病具有良好的预防和治疗作用。近年来研究发现，运动可以通过调节 miRNA 的表达，发挥心肌保护效应。在心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、糖尿病性心肌病、心衰等心脏疾病中，均发现有miRNA 参 与 了
10、运 动 的 心 肌 保 护 作 用（Fernandes et al.，2018；Liu et al.，2015）。有氧运动及抗阻运动均能调节 miR-133 的表达。研究表明，有氧运动可提高循环中 miR-133a 的表达以及心肌中 miR-133b 的表达（Melo et al.，2014；Ramasamy et al.，2015），而抗阻运动对 miR-133 前体的表达有显著影响（Drummond et al.，2008）。但运动对病理性心肌肥大时内源性 miR-133表达的影响以及 miR-133在运动改善心脏重塑中发挥的作用均鲜见报道。综上，本研究通过腹主动脉缩窄（abdominal
11、 aortic coarctation，AAC）建立大鼠病理性心脏重塑模型，进行 4 周的跑台运动干预和 agomir-133给药后，观察病理性心脏重塑和心肌细胞凋亡的变化，检测心肌和循环中 miR-133 表达情况，探讨 miR-133 在运动改善心脏重塑中的作用及机制。1 实验对象与方法 1.1 实验动物与材料所有的动物维持和实验方案均符合北京师范大学伦理与动物委员会的要求（批准号CLS-EAW-2015-002）。5周龄雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量 190230 g，共 24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2014-
12、0001。动物分笼饲养，室内温度（225），湿度 50%10%，明暗交替周期为 12 h，自由进食和饮水。所有动物饲料及垫料均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，苏木素-伊红染液和天狼星红染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，agomir-133过表达试剂（micrON rno-miR-133a-3p agomir，产品编号miR40000839-4-5）及 agomir 阴性对照（micrON agomir NC#22，产品编号 miR4N0000001-4-5）购自广州市锐博生物科技有限公司，TUNEL试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司，血浆肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN
13、）浓度测定酶联免疫（ELISA）试剂盒购自 R&D（美国）。实验中所用其他试剂均为市售分析纯试剂。1.2 实验动物分组与心脏病理性重塑模型制备实验动物分组：大鼠随机分为假手术组（CON组，n=6）、腹主动脉缩窄手术（abdominal aortic coarctation，AAC）组（AAC 组，n=6）、AAC运动agomir-NC 组（AENC组，n=6）以及 AAC运动agomir-133 组（AEagomir-133组，n=6）。心脏病理性重塑模型制备：使用腹主动脉缩窄构建大鼠心脏病理性重塑模型。5 周龄 SD 大鼠适应性饲养 1 周后准备手术，术前禁食12 h，并在手术前自由饮水。通
14、过腹腔注射 50 mg/kg 的戊巴比妥钠（Sigma，美国）进行麻醉，然后仰卧位固定。大鼠左腹部备皮，3%碘伏消毒；在左肋弓下缘和腹部中线旁各 0.5 cm处纵向切开 1.52.0 cm，逐层分离皮下组织、进入腹腔；在左肾动脉上方分离腹主动脉，用银夹造成腹主动脉部分狭窄（银夹内径 0.7 mm）；在缝合伤口前，将适量的青霉素（400 000 U/mL）滴入腹腔，然后逐层缝合、关腹。假手术组仅打开腹腔，分离腹主动脉，不用银夹缩窄，所有其他步骤与手术组相同。术后正常饮食，密切观察动物反应。1.3 跑台运动方案及agomir-133注射方案跑台运动方案：AAC 手术 4 周后，AENC 组及AEa
15、gomir-133 组大鼠进行跑台训练。第 1 周，大鼠每天以 5 m/min的速度运动 15 min，进行适应性训练；第二周开始，大鼠以 12 m/min的速度跑步 40 min。所有训练均在下午（15001800）进行，每周进行 5 天训练（周一至周五），共进行4周训练。agomir-133 注射方案：AAC 手术 4 周后，在每周一和周四进行跑台训练前 1 h 进行注射，AEagomir-133 组大鼠于右后肢腓肠肌多点注射 agomir-133，AENC 组大鼠在相同部位注射 agomir-NC，每只每次注射量均为20 L，浓度12.5 nmol/mL，共注射4周。1.4 超声心动检测
16、大鼠末次运动 24 h 后，进行超声心动检测，使用 VisualSonics Vevo2100 小动物超声成像系统（Fujifilm VisualSonics，加拿大）。测定前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，胸部备皮，仰卧位将头部及四肢固定在木板上，将探头置于左前胸，与前正中线呈30左右夹角，显示胸骨旁左室长轴切面，探头顺时针旋转90可显示左室短轴切面图像。于胸骨旁左室长轴切面二维测量左室室壁厚度等，通过顺时针旋转探头 90显示左心室短轴截面图像，在胸骨旁左心室纵轴上测量左心室壁厚度。在二维图像的引导下，将取样线置于左室健索水平，取 M 型曲线，进行心功能测量。超声心动图测量指标包括：左室舒张末期内径（left ventricular inner dimension diastolic，LVID；d）、左室舒张末期前壁厚度（left ventricular anterior wall diastolic，LVAW；d）、左室舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall diastolic，LVPW；d）和 左 室 射 血 分 数
