1、化学试剂 第 卷第 期分离提取技术编者按：本栏目由来自福建农林大学的青年编委卢旭副教授组稿，共收录 篇论文，主要涉及天然活性产物提取与分离技术应用及产物活性表征的内容。传统的有机溶剂已广泛应用于食品资源中各种生物活性成分的提取、分离和纯化，但依然存在提取得率低、处理步骤复杂、部分试剂存在毒性等问题。近年来一些新型绿色溶剂（如离子液体、超临界流体等）、新型提取模型（如响应面和神经网络等）与新型提取技术（闪式提取技术、超声微波联用提取技术、生物酶法提取技术等）被开发出来，并应用于提取、分离和纯化食品资源中的各种生物活性成分。提取分离方法的应用已引起医学、药学等领域专家的强烈兴趣，并为化合物结构与活
2、性的基础研究发展作出了重要贡献。收稿日期：；网络首发日期：基金项目：国家自然科学基金面上基金项目（）；福建省对外合作项目（）；“中爱国际合作食品物质学与结构设计研究中心”项目（）；福建农林大学杰出青年科研人才计划项目（）；福建农林大学科技创新专项基金项目（，）。作者简介：郑舒怡（），女，福建泉州人，硕士生，主要研究方向为食品加工与营养。通讯作者：卢旭，：。引用本文：郑舒怡，左佳昕，戴鑫，等响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究化学试剂，（）：。响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究郑舒怡，左佳昕，戴鑫，高淑娟，张怡，卢旭，（福建农林大学 食品科学学院，福建 福州；福建省特种淀粉品质科学与加工技
3、术重点实验室，福建 福州；中国爱尔兰国际合作食品物质学与结构设计研究中心，福建 福州；农业农村部亚热带特色果蔬菌加工重点实验室（部省共建），福建 福州）摘要：以薏苡仁为原料，选取酶解温度、料液比、淀粉酶添加量以及酶解时间 个因素进行单因素试验，利用响应面法建立数学模型，根据所得模型分析 个因素对寡糖得率的影响，最后对提取工艺进行优化。结果表明最佳工艺条件为：料液比.（）、酶添加量.、酶解时间.、酶解温度.，其中对薏苡仁寡糖得率影响最大的因素条件为酶解温度。在该条件下，薏苡仁寡糖得率为.，与模型预测值.接近，该工艺条件切实可行，可用于预测薏苡仁寡糖的提取。关键词：薏苡仁；寡糖；酶解；响应面；提取
4、过程中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，；，；，（），）：，.（），.，.，第 卷第 期郑舒怡等：响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究 .，.，.：；薏苡仁（），又称薏米、米仁等，是禾本利植物薏苡干燥后的成熟种仁。我国人工栽培的薏苡仁历史沉淀深厚、覆盖范围广，主要存在于辽宁、福建、江苏等地区。薏苡仁是传统药食两用植物，富含营养活性物质，其中淀粉含量为，蛋白质含量为.，脂肪含量为.，除此外还有类黄酮、多糖等营养物质。自古以来薏苡仁就有益脾、健胃、祛湿等功效。现代功能学研究显示其具有抗肿瘤、减脂降压、调节免疫功能等药理活性，临床上也将薏苡仁油作为主要原料用于抗癌治疗等药品。寡糖又称
5、低聚糖，是由 个单糖分子通过，糖苷键连接而成的低度聚合糖，当寡糖本身被吸收时，会释放相当多的短链脂肪酸，调节肠腔的酸性环境，促进肠内矿物质吸收；同时，寡糖可以作为原料，通过葡萄糖苷酶的作用产生麦芽糖，可以转变成一系列非发酵性低聚糖，其不易被吸收，但可被双歧杆菌作用，有助其繁殖，有效阻止胃肠中有害微生物进一步增长，增强机体抵抗力；寡糖不易被链球菌发酵，且具有良好的防龋齿功能；此外寡糖具有的易降解和成膜性还可用于食品包装。寡糖的提取工艺包含酶解法、生物法、溶剂浸提法、超声波辅助法和蒸汽爆破技术等，。酶解法与其他的提取工艺相比条件温和、提取率高、成本低，且可以保持寡糖的功能性。此外微生物发酵法是一种
6、利用酵母在生长过程中不能利用功能性寡糖，而除去小分子非功能性糖类，从而对薏苡仁寡糖起到去杂纯化效果。由于薏苡仁淀粉含量较高，因此可选用淀粉酶进行提取，酵母去除单糖和二糖，运用酶结合微生物发酵的方法，可以进一步提高提取寡糖的得率和抗消化性能。目前薏苡仁的提取研究主要集中在蛋白质、淀粉、多糖、油脂方面，发酵酶解法提取薏苡仁寡糖却鲜有报道，因此该实验可以为薏苡仁寡糖的综合利用提供依据。响应面设计法（，）将多元二次回归方法当作工具，估计函数，分析对等高线和函数的响应面，拟合响应面和各因子的函数关系，可以短期、有效、准确地处理大量数据，并在食品工艺设计中得到普遍应用。本研究以薏苡仁为原料，采用响应面法进
7、行酶解提取寡糖，挑选最优提取工艺，优化薏苡仁寡糖得率。实验部分.主要仪器与试剂 型紫外可见分光光度计（北京市普析通用仪器公司）；型旋转蒸发器（上海市亚荣生化仪器厂）；型中草药粉碎机（天津市泰斯 特 仪 器 有 限 公 司）；目 试 验 标 准 筛（.，上虞市银河测试仪器厂）。苯酚、乙醇、浓硫酸、葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；酵母、淀粉酶（上海源叶生物科技有限公司，来源于米曲霉，比酶活力 ）；薏苡仁（福建省三明市杨晨食品有限公司）；实验室用水为二次蒸馏水。.实验方法.酶解提取薏苡仁寡糖的工艺流程参考文献的方法制备，薏苡仁打碎过 目筛加 水搅拌加.淀粉酶进行酶解 灭酶（）添加一定量的
8、酵母进行酵解抽滤 进行真空浓缩（至 原体积）加乙醇进行沉降过滤真空浓缩（无醇味为止）定容至 稀释 倍（用 定容）测总糖（苯酚硫酸法）工艺要点如下：）酶解：下，薏苡仁粉水溶液加 淀粉酶酶解 ，酶解终点用碘试纸确定。）酵母：在 的条件下，加入原料质量 的酵母、的糖、倍酵母量的水（），经过活化 后进行使用（即先将.酵母、.葡萄糖、水混合后，置于 中进行复水活化 添加使用）。）醇沉降：将 倍用量的 乙醇加入提取液中，搅拌，于 的条件下进行沉降过夜（）。.薏苡仁寡糖含量的测定 支具塞试管（进行编号）分别加入.、化学试剂 第 卷第 期.、.、.、.、.对照品溶液加 水加 苯酚摇至均匀加 浓硫酸 摇至均匀
9、静放 水浴（，）冷却（至室温）测 值（）。结果得标准曲线公式为：.，用该吸光度计算样品中的寡糖含量和寡糖得率。寡糖得率（）葡萄糖浓度 定容体积 稀释倍数 （样品质量 ）测试时取 稀释样液、苯酚、浓硫酸，冷却，于 波长下测吸光度值。.单因素试验设计称取 薏苡仁干粉，固定 淀粉酶添加量.、酶解时间 、酶解温度 ，分别采用、（）料液比，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的料液比对寡糖得率的影响。称取 薏苡仁干粉，固定料液比 （）、酶解时间 、酶解温度 ，分别采用.、.、.、.、.、.、.、.、.、.的酶添加量，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的酶添加量对寡糖得率
10、的影响。称取 薏苡仁干粉，固定料液比为 （）、淀粉酶添加量为.、酶解温度，分别采用、的酶解时间，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的酶解时间对寡糖得率的影响。称取 薏苡仁干粉，固定料液比 （）、淀粉酶添加量.、酶解时间，分别采用、的酶解温度，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的酶解温度对寡糖得率的影响。.响应面试验设计试验设计见表。表 响应面因素设计 料液比（）酶添加量酶解时间酶解温度.数据处理各试验做 次平行，结果取平均值；分别利用.、.软件，对试验数据进行分析，绘图和建立响应面模型。结果与讨论.单因素对测定薏苡仁中寡糖得率的影响.不同料液比对薏苡仁寡糖得
11、率的影响从图 可以看出，寡糖得率随料液比提升而上升，可能是料液比提高，传质推动力上升，寡糖扩散过程增快；当其超过（）后，寡糖得率下降并逐渐趋于稳定，这可能由于酶与底物接触机会减少、细胞壁降解减弱，寡糖扩散减慢，并且料液比过大也会浪费溶剂不利实际生产以及后续浓缩，所以将料液比控制在 （）最适宜。图 料液比对薏苡仁寡糖得率的影响 .不同酶添加量对薏苡仁寡糖得率的影响由图 可知，随着酶添加量的增加，薏苡仁寡糖的得率稳步上升，在酶添加量为.时达到峰值，后寡糖得率呈现下降趋势，水解程度的增加可能使寡糖含量达到饱和状态，小分子低聚糖的水解属于多链式反应，水解到一定程度后低聚糖的水解速度变慢甚至有些低聚糖不
12、能水解，所以 淀粉酶添加量为.最适宜。图 酶添加量对薏苡仁寡糖得率的影响 第 卷第 期郑舒怡等：响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究.不同酶解时间对薏苡仁寡糖得率的影响由图 可知，随酶解时间延长，薏苡仁寡糖得率逐步递增，但是当超过 后，寡糖得率逐渐趋于稳定，时间太短会提取不充分，甚至酶活性没被激活，时间增长薏苡仁颗粒已经充分溶胀，寡糖也得到充分溶出，但是时间的延长，部分溶液中的游离氨基酸可能与寡糖进行美拉德反应，使溶液变深，寡糖得率也会因此受到不良的影响，故酶解时间为 最适宜。图 酶解时间对薏苡仁寡糖得率的影响 .不同酶解温度对薏苡仁寡糖得率的影响从图 可知，酶解温度递增的同时，薏苡仁寡糖的
13、得率逐步升高，为峰值，每种酶都有特定的最适温度范围，在此范围内酶活性与温度成正比，进一步促进体系的热运动，寡糖的得率增大，但是温度过高会破坏寡糖和酶结构，导致酶变性甚至失活，而且温度过高产品的品质也会有所下降，故 为最适宜酶解温度。图 酶解温度对薏苡仁寡糖得率的影响 .响应面法优化薏苡仁寡糖提取的工艺条件.响应面试验结果单因素试验分析结果显示，个因素对薏苡仁寡糖得率均有显著的影响效果。在此基础上，通过响应面探索薏苡仁寡糖提取的最佳条件，响应面试验设计及结果见表。表 试验设计及结果 试验号料液比（）酶添加量酶解时间酶解温度得率.模型方差分析以薏苡仁中寡糖得率为响应值，进行多元回归分析拟合，得到回
14、归方程：.，回归模型方差分析结果见表。从表 可以看出 值、失拟差 值、拟合结果用系数（）、修正的关联系数（）、预测修正的关联系数（）和变化系数（）。回归模型 值小于.，表明回归模型极显著，且其失拟差 值为.，表明该模型有较高的拟合度，可以用来分析薏苡仁寡糖提取的工化学试剂 第 卷第 期表 回归模型的方差分析注 方差来源平方和自由度均方标准误差置信限低高 值 值显著性模型.残差.失拟项.纯误差.总离差.注：表示为极显著，表示为显著。艺参数。较高并不表示该模型为可靠的回归模型，也会增加模型中的变量，它与变量没有显著相关性。因此，可以选用 用于评估模型的可靠性。若项数或样本容量不够大，将明显小于。从
15、表 可知，略小于，和之间存在的差异.，因此它们处于合理的波动范围内。表示标准误差与试验观察平均值的比值，以评估模型的再现性。若 大于，则平均值的变化程度太高，该模型的可靠性低；若 值较低，则表明平均值偏差程度较低，从而表明试验结果的可靠性高，由表 中的 值可知该模型准确可靠。越大，该因子作用效果越显著。通过表 可以看出，各因子影响程度为。偏回归系数中、为极显著，为显著，说明酶添加量、酶解温度对结果有极显著作用效果，酶解时间有显著作用效果；交互项均为不显著（.）说明交互项无显著作用效果；二次项中、的偏回归系数极显著，表明酶添加量、酶解温度对薏苡仁寡糖得率影响不存在简单的线性关系。.响应面结果分析
16、响应面图是由响应值与各因子通过多元线性回归方程构成的曲面图，其坡度可以体现这一因子的作用程度，相互作用曲线越陡峭，则说明该因子对薏苡仁寡糖得率的影响越大，同时对于反应值的改变幅度越大，。变量间的交互作用程度可以通过其形状看出，其中椭圆形、马鞍形表示交互作用较强，而圆形则相反，极值存在的条件则在圆心处。由图 可知，在酶添加量.、酶解温度 时，薏苡仁寡糖得率达峰值，而后随酶添加量、酶解温度推移，薏苡仁寡糖得率减少。由图 可知，在酶解时间 、酶解温度 时，寡糖的得率达峰值，之后随酶解时间、酶解温度的增加，薏苡仁寡糖得率下降。图 可知，在酶添加量为.、酶解时间在 时，薏苡仁寡糖得率达峰值，之后随酶添加量、酶解时间的推移，薏苡仁寡糖得率减少。从图 可以看出，倘若另外 个因子不变，寡糖产量将随着时间的推移逐渐增加，表现为等高线之间的差距扩大，但趋势拐点不明显，相互第 卷第 期郑舒怡等：响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究 图 酶解温度、酶添加量对薏苡仁寡糖得率影响的响应面图（）和等高线图（）（）（）图 酶解温度、酶解时间对薏苡仁寡糖得率影响的响应面图（）和等高线图（）（）（）叠加的影响不显著，表
