1、第 51 卷第 3 期2023 年 2 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.3Mar.2023向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下INS-1 细胞保护作用研究翟语桐,张刘颖,叶升敏,冯琛博,刁康阳,饶承钿,段静雨(徐州医科大学药学院,江苏省新药研究与临床药学重点实验室,江苏 徐州 221004)摘 要:为了探究向天果中 swietenine(Stn)及 swietenolide(Std)对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用。使用不同浓度的过氧化氢作用于 INS-1 细胞 4 h,CCK-8 法筛选出合适的造模条件;将向天果正丁醇层活性成分
2、 Stn、Std 和阳性药格列齐特(Gli)作用于INS-1 细胞 24 h,CCK-8 法筛选出化合物的安全作用浓度;在过氧化氢损伤模型下,将化合物作用于 INS-1 细胞 24 h 后,分别检测细胞活力并计算细胞存活率和 ROS 水平变化;使用胰岛素 ELISA 试剂盒检测葡萄糖浓度分别为 3.3 mM 和 16.7 mM 刺激下的胰岛素分泌量,模拟 BIS 和 GSIS 下胰岛素分泌量。化合物 Stn、Std 可以提高氧化损伤下 INS-1 细胞的存活率,促进胰岛素分泌,降低 ROS 水平,促进细胞增殖,改善细胞凋亡状况。化合物 Stn、Std 可保护氧化损伤下 INS-1 细胞。关键词
3、:向天果;氧化损伤;INS-1;swietenine;swietenolide中图分类号:TK224.1 文献标志码:B文章编号:1001-9677(2023)03-0104-04 基金项目:江苏省大学生创新创业训练计划项目(202210313096Y)。第一作者:翟语桐(2002-),在读学士。通讯作者:段静雨,博士,副教授,研究方向为中药活性物质筛选及中药药理学。Protective Effects of Swietenine and Swietenolide Isolated fromSwietenia Macrophylla King on INS-1 Cells Induced by
4、 Oxidative DamageZHAI Yu-tong,ZHANG Liu-ying,YE Sheng-min,FENG Chen-bo,DIAO Kang-yang,RAO Cheng-dian,DUAN Jing-yu(School of Pharmacy,Jiangsu Key Laboratory New Drug Research and Clinical Pharmacy,Xuzhou Medical University,Jiangsu Xuzhou 221004,China)Abstract:In order to explore the protective effect
5、 of Swietenine(Stn)and Swietenolide(Std)on INS-1 cells underoxidative damage,INS-1 cells were treated with different concentrations of hydrogen peroxide for 4 h,and the appropriatemodeling conditions were screened by CCK-8 method.Ins-1 cells were treated with Stn,Std and gliclazide(Gli)for 24 h.The
6、safe concentration of the compounds was screened by CCK-8 method.Under the model of hydrogen peroxide injury,INS-1 cells were treated with the compound for 24 h,and the cell viability,cell survival rate and ROS level weredetected,respectively.Insulin secretion stimulated by 3.3 mM glucose and 16.7 m
7、M glucose was detected by insulinELISA kit to simulate the insulin secretion under BIS and GSIS.The final results showed that compounds Stn and Stdcould improve the survival rate of INS-1 cells under oxidative injury,promote insulin secretion,reduce ROS level,promote cell proliferation,and improve c
8、ell apoptosis.Compounds Stn and Std could protect INS-1 cells from oxidativedamage.Key words:Swietenia macrophylla;N-butanol layer;swietenine;swietenolide向天果是楝科桃花心木属植物大叶桃花心木(Swieteniamacrophylla King)的果实,因其果实向天生长而得名1。马来西亚草药目录 中记载,向天果味苦、涩、性凉,解热、收敛2。当地百姓常将向天果煎煮服用来治疗糖尿病、高血压、高血脂等内分泌失调病症3。近几年国内外的研究表明,向天果
9、具有治疗糖尿病的临床功效,同时还有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤的药理活性4。糖毒性是导致胰岛 细胞凋亡的直接原因,主要以葡萄糖毒性为主,促进 ROS 和一些糖基化终端产物葡萄糖胺的生成,从而出现胰岛 细胞表现出氧化应激的状态,导致胰岛 细胞功能的损伤,诱发凋亡,而线粒体在凋亡过程中起关键作用5。在线粒体凋亡通路中,抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax 是传递凋亡信号的关键蛋白,线粒体膜受损形成孔道导致释放其内部各种调控凋亡蛋白,氧化应激会上调促凋亡基因 Bax 表达,下调抗凋亡基因 Bcl-2 表达6,这些因素加剧了调控凋亡的相关蛋白从线粒体膜间隙释放,引发下游凋亡的级联反应,促使细胞凋亡
10、7。因此,本实验以大第 51 卷第 3 期翟语桐,等:向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用研究105 鼠 INS-1 细胞为基础建立氧化损伤模型。通过检测胰岛素分泌量、ROS 水平变化、细胞存活率等,探究向天果中柠檬苦素类化合物 swietenine 及 swietenolide 保护 INS-1 细胞的作用机制,为开拓抗型糖尿病药物研究提供实验依据和新方向。1 材料与仪器1.1 材 料实验中所用的材料 swietenine(Stn)及 swietenolide(Std)均为本实验室中分离得来,纯度大于 99.9%。1.2 仪 器实验中用到的主要仪器有:IX53 倒置
11、显微镜,OLYMPUS公司;BX43F 正置荧光显微镜,OLYMPUS 公司;VE 180 Tanon垂直电泳系统,上海天能科技公司;164-5052 Western 电泳-转印电源,Bio-Rad 公司;170-3940 Bio-Rad 半干转印系统,Bio-Rad 公司;电泳仪,Hoefer 公司;凝胶照相分析系统,Bio-Rad公司。1.3 试 剂格列齐特(Gli),10 mmol/L PBS buffer,PBST 洗膜液等。2 实验方法2.1 H2O2诱导 INS-1 细胞氧化损伤条件的筛选及格列齐特(Gli)对 INS-1 细胞安全作用浓度的筛选本实验分组为 H2O2浓度组和空白对
12、照组,同时每组设 5个复孔。使用酶标仪测定 450 nm 处吸光度 INS-1 细胞存活率计算:细胞存活率=(A空白-A加药)/A空白100%2.2 化合物 Stn、Std 对 INS-1 细胞低、中、高剂量的筛选化合物浓度设置为 2 M、5 M、8 M、10 M、15 M、20 M、30 M、40 M、50 M,方法同 2.1。2.3 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞存活率的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn 低、中、高剂量组、Std 低、中、高剂量组,同时每组设置 5 个复孔。加入终浓度为 10 M 的 Gli 为阳性药组,Stn 终浓度为:5、15、
13、30 M,Std 终浓度为:5、20、50 M,每孔加入 100 L 培养液,空白对照组和模型组加入等量空白培养液,37,5%CO2,培养箱孵育 24 h;其余方法同 2.1。2.4 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞内ROS 水平的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn、Std 低剂量组、Stn、Std 中剂量组、Stn、Std 高剂量组,同时每组设置 5 个复孔。使用酶标仪测定荧光强度,488 nm 为激发波长,525 nm 为发射波长。2.5 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、S
14、tn、Std 低剂量组、Stn、Std 中剂量组、Stn、Std 高剂量组,同时每组设置 3 个复孔。按照大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒(泉州睿信生物科技公司)的操作步骤进行胰岛素分泌量的检测;在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值;将测定的 OD 值代入标准曲线,计算各孔的胰岛素分泌量。3 结 果3.1 筛选 H2O2对 INS-1 细胞诱导损伤的条件如图1 所示,各个浓度下 H2O2对 INS-1 细胞在处理4 h 内细胞存活率的变化情况,以 50 1000 M 浓度的 H2O2处理4 h,50 200 M 浓度内细胞存活率下降平缓,并保持在 80%以上,在 200 500 M 浓度
15、内细胞对 H2O2的浓度变化表现为十分敏感,细胞存活率急剧下降,细胞存活率迅速降至 20%左右,在 600 1000 M 浓度内细胞存活率下降平缓,推测在此浓度下细胞已经出现急性损伤导致死亡。最终选用 300 MH2O2处理 4 h 作为造模条件。图 1 不同浓度 H2O2处理下的细胞存活率Fig.1 Cell survival rate under different concentrations of H2O23.2 筛选格列齐特(Gli)对 INS-1 细胞的安全作用浓度如图 2 所示,2 50 M 下不同浓度的格列齐特作用 INS-1细胞 24 h 后,测得细胞存活率的变化情况,各个浓
16、度下细胞存活率相较对照组均表现出显著性差异(P0.05),同时在2 50 M浓度下,细胞存活率均保持在 90%以上,可以说 2 50 M 为作用的安全浓度,且在 10 M 浓度下,细胞存活率出现了上升,最终选择 10 M 浓度为后续实验中格列齐特的作用浓度。图 2 不同浓度 Gli 处理后的细胞存活率Fig.2 Survival rate of cells treated with differentconcentrations of Gli3.3 筛选化合物 Stn、Std 对 INS-1 细胞的低、中、高剂量106 广 州 化 工2023 年 2 月如图 3 所示,2 50 M 不同浓度的 Stn 作用于 INS-1 细胞24 h 后,测得细胞存活率的变化情况。在化合物 Stn 的不同浓度下,细胞存活率均出现不同程度的提高,且相较于对照组均有显著性差异(P0.05),其中在 2 30 M 浓度内,细胞的存活率出现剂量依赖性的提高,故最终选择 5 M 为作用细胞的低剂量,15 M 为作用细胞的中剂量,30 M 为作用细胞的高剂量。图 3 不同浓度的 Stn 对细胞存活率的影响Fig.
