1、第 43 卷第 2 期2023 年 4 月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol.43 No.2Apr.2023 收稿日期:2022-01-18 基金项目:国家自然科学基金资助项目(31800614)作者简介:刘 勇(1999),男,安徽宿州人,硕士生,主要从事提取物化学与利用研究工作 通讯作者:黄立新,研究员,博士生导师,研究领域为植物提取与应用研究;E-mail:l_x_。研 究 报 告doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2023.02.002响应面优化皂角刺皂苷超声波辅助提取工艺及其降血糖活
2、性LIU Yong刘 勇,张彩虹,谢普军,邓叶俊,黄立新(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210042)摘 要:在单因素试验基础上,采用响应面法优化超声波辅助提取皂角刺皂苷的最佳工艺,并考察了最佳提取工艺下提取物对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制活性。实验结果表明:皂角刺总皂苷超声波辅助提取的最佳工艺为液料比 161(mLg)、乙醇体积分数 60%、超声波时间 80 min 和提取温度 50,在此条件下皂角刺总皂苷得率为 13
3、.28%0.25%。最佳工艺下的提取物对-葡萄糖苷酶的半数抑制质量浓度(IC50)值为(0.146 0.019)g/L,强于阳性对照阿卡波糖 IC50值(0.48 0.18)g/L);当提取物质量浓度为2 g/L 时,对-淀粉酶抑制率可达 35.13%0.58%,表明皂角刺具有开发成为型糖尿病药物的潜力。关键词:皂角刺皂苷;响应面;-葡萄糖苷酶;-淀粉酶中图分类号:TQ35;R284 文献标志码:A 文章编号:0253-2417(2023)02-0012-07引文格式:刘勇,张彩虹,谢普军,等.响应面优化皂角刺皂苷超声波辅助提取工艺及其降血糖活性J.林产化学与工业,2023,43(2):12-
4、18.Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Saponins fromGleditsia sinensis Thorn by RSM and Its Hypoglycemic ActivityLIU Yong,ZHANG Caihong,XIE Pujun,DENG Yejun,HUANG Lixin(Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Provi
5、nce;KeyLab.of Chemical Engineering of Forest Products,National Forestry and Grassland Administration;National EngineeringResearch Center of Low-Carbon Processing and Utilization of Forest Biomass;Jiangsu Co-InnovationCenter of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,Nanjing 210042,C
6、hina)Abstract:On the basis of single factor experiment,response surface methodology(RSM)was used to optimize the ultrasonic-assisted extraction optimum process of saponins from Gleditsia sinensis Thorn(GST),and the inhibitory activities of the extractson-glucosidase and-amylase were investigated und
7、er the optimal extraction conditions.The results showed that the optimalultrasonic-assisted extraction conditions were solid-liquid ratio of 161(mLg),ethanol volume fraction of 60%,ultrasonic timeof 80 min and extraction temperature of 50.Under these conditions,the yield of total saponins was 13.28%
8、0.25%,andthe IC50value of-glucosidase was(0.146 0.019)g/L,which was stronger than that of positive control acarbose with themedian inhibitory concentration(IC50)value of(0.48 0.18)g/L.When the mass concentration of the extract was 2 g/L,theinhibition rate of-amylase could reach 35.13%0.58%,indicatin
9、g that GST had the potential development into a drug for第 2 期刘 勇,等:响应面优化皂角刺皂苷超声波辅助提取工艺及其降血糖活性13 type II diabetes.Key word:saponins of Gleditsia sinensis Thorn;response surface methodology;-glucosidase;-amylase皂角刺是豆科皂荚属皂荚的棘刺,主要分布于中国的江苏、湖北、河南、山东和四川等地1。皂角刺中含有多酚2、黄酮3、皂苷4、多糖5、生物碱6等化合物,其富含的齐墩果酸型皂苷具有抗肿瘤7、抗
10、氧化8、抗菌9、杀虫10等活性,具有较高的药用价值。皂苷作为非离子型表面活性剂11,以三萜或甾体为皂苷元并连接 1 2 条糖苷链12,在疏水性药物的运载方面具有广阔的应用前景。皂苷的提取方法包括传统溶剂提取法、超声波辅助提取法13、微波辅助提取法14等。超声波具有使物质结构变疏松、提高物质的溶出效率等特点,因此被广泛应用于植物有效成分的提取。淀粉作为最重要的碳水化合物来源,在人类饮食中贡献了 40%60%的能量。然而,人体对淀粉的快速消化会导致餐后血糖的快速升高,这与一些代谢疾病(如型糖尿病)和心血管疾病具有很大的相关性15。通常,淀粉被-淀粉酶消化为麦芽糖和糊精,并进一步被-葡萄糖苷酶转化为
11、葡萄糖,从而使血糖升高。因此,降低-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性是缓解餐后血糖升高的有效方法16。研究表明,天然化合物可以抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性,从而显著降低淀粉水解速率。本研究采用超声波辅助提取皂角刺皂苷,在单因素试验的基础上,通过响应面法优化皂角刺皂苷提取工艺,并探究了皂角刺提取物对-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制活性,以期为皂角刺总皂苷的提取利用提供参考。1 材料与方法1.1 原料、试剂与仪器皂角刺,购于河南嵩县;齐墩果酸及阿卡波糖标准品、-葡萄糖苷酶(G5003,100UN,来源于酵母)、-淀粉酶(500 kU,来源于猪胰腺),美国 Sigma 公司;4-硝基苯-D-吡喃葡萄糖苷(PN
12、PG),阿拉丁试剂(上海)有限公司;其余试剂均为国产分析纯。AS 系列超声波清洗机,天津奥特赛恩斯仪器有限公司;MULTISKAN GO 型酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;3400-I 型扫描电子显微镜(SEM),日本日立公司;DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱。1.2 皂角刺总皂苷的提取皂角刺经清洗、晾干、粉碎,干燥后过 0.25 mm 筛,备用。称取 1.0 g 样品加入 100 mL 带塞锥形瓶中,按不同的液料比值(5、10、15、20 和25),加入一定体积分数(50%、60%、70%、80%和90%)的乙醇溶液,超声波功率 400 W,于一定温度(30、40、50、60
13、 和 70)下恒温加热提取一定时间(10、15、20、25 和 30 min)。提取结束后,提取液转移至离心管中,5 000 r/min 离心 5 min,取上清液为皂苷粗提液。在单因素试验基础上,采用 Box-Behnken 设计方案,以液料比值(X1)、乙醇体积分数(X2)和超声波时间(X3)为考察因素,皂苷得率为响应值(Y),利用 Design-Expert 8.0.6 软件优化皂角刺皂苷提取工艺。1.3 总皂苷含量的测定采用分光光度法测定总皂苷含量17,并稍作改动。以齐墩果酸作为标准品,配制1 g/L原液,稀释成质量浓度为 0.1 0.8 g/L 样品溶液。准确移取 0.5 mL 样品
14、溶液,冰水浴条件下加入 8%香草醛-乙醇溶液0.5 mL,混匀后加入77%硫酸4 mL,摇匀放置于60 水浴加热15 min,迅速用冰水降温10 min,室温下测量最大吸收波长为544 nm 处的吸光度,重复测量3 次。以吸光度为纵坐标(y),样品质量浓度为横坐标(x),得线性回归方程为:y=1.085 4x+0.085 9(R2=0.999 6),以水作为空白对照。按同样方法测定皂苷粗提液中总皂苷含量,以等体积水作为空白对照,根据标准曲线方程计算溶液中皂苷得率(Y),计算方法见式(1):Y=(C-C0)V/m 100%(1)式中:C皂苷粗提液中皂苷的质量浓度,g/L;C0空白对照组皂苷质量浓
15、度,g/L;V皂苷粗提液体积,mL;m原料质量,mg。14 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷1.4 超声波对样品形貌及总皂苷溶出率的影响采用 1.2 节方法,常温下按液料比 151(mLg,下同)加入 60%乙醇超声波提取 40 min,收集滤液和滤渣。测量滤液中总皂苷得率,滤渣烘干后在 SEM 下观察其形貌,以相同条件下不加超声波组作为空白对照。1.5 皂角刺提取物的降血糖活性1.5.1 样品制备 将最佳工艺条件下制备的提取液在 40 旋蒸完乙醇后,样品冻干备用。1.5.2-葡萄糖苷酶抑制活性测定 将 100 L-葡萄糖苷酶溶液(0.5 U/mL)加入到 50 L 不同质量浓度的皂角刺
16、提取液中,37 下孵育 10 min 后,加入 50 L PNPG(5 mmol/L)混合孵育 5 min 后,加入 50 L Na2CO3(0.2 mol/L)终止反应,在 405 nm 处测定样品吸光度。整个过程在 96 孔板中完成,实验中所需的溶液均使用 pH 值 6.8(0.1 mol/L)磷酸盐缓冲液(PBS)配制或稀释。以等量 PBS 作空白对照,等量阿卡波糖作阳性对照。样品对-葡萄糖苷酶抑制效果以半数抑制质量浓度(IC50)表示18,抑制率()计算方法见式(2):=1-(A样品-A空白)/A对照 100%(2)式中:A样品样品组(酶+样品+PNPG)吸光度;A空白空白组(PBS+样品+PNPG)吸光度;A对照对照组(酶+PBS+PNPG)吸光度。1.5.3-淀粉酶抑制活性测定 将50 L-淀粉酶溶液(2.5 U/mL)加入到 25 L 样品溶液(2 g/L)中,37 下孵育10 min 后,加入50 L 0.05%淀粉溶液,37 孵育10 min 后加入25 L HCl(1 mol/L)终止反应,再加入100 L I2/KI 溶液显色,在630 nm 处测定样品和空白对照
