1、安徽科技学院学报，（）：收稿日期：基金项目：安徽省重点研究与开发项目（）；安徽省果树产业技术体系果品加工与流通岗位专家项目（）。作者简介：王大全（），男，安徽淮北人，硕士研究生，主要从事农产品加工研究。通信作者：杨剑婷，副教授，：。响应面优化酶法提取蓝莓果渣多酚工艺研究王大全，王俊颖，翟立公，时志军，曹双双，杨剑婷（安徽科技学院 食品工程学院，安徽 凤阳 ；安徽省凤阳县健民蓝莓农业发展有限公司，安徽 凤阳 ）摘要：目的：用纤维素酶提取蓝莓果渣多酚，以多酚得率为指标优化提取工艺。方法：选取纤维素酶添加量、酶解、料液比、酶解时间、酶解温度等种因素分别利用单因素试验和响应面分析法，研究蓝莓果渣多酚最
2、佳提取工艺。结果：当纤维素酶用量为，提取初始 为，料液比为，提取时间为，温度为 时，蓝莓果渣中多酚的得率最高，达到 。结论：纤维素酶水解法提取蓝莓果渣多酚，通过调整酶添加量、酶解、料液比、酶解温度、酶解时间可以显著增加蓝莓果渣多酚得率。关键词：蓝莓果渣；多酚；纤维素酶；响应面分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（）开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，）：，：，：，：，：；蓝莓又称越橘，为多年生落叶常绿灌木，蓝莓果实为红色、紫色或蓝黑色的小浆果，形状接近圆形。其果实中含有较多的人体营养成分，具有良好的养生功效，如保护视力，强健心脏，以及增强机体免疫力，延缓神经衰老等功能。目前，蓝莓以其丰
3、富的营养价值和良好的生物功效，引起了人们的广泛关注，从而促进了蓝莓制品产业的发展。利用蓝莓为原料，已经生产出了不同种类的产品，如蓝莓粉、蓝莓果冻、蓝莓果酱以及蓝莓味饮料等。多酚是分子中具有多种羟基酚的总称，为次生代谢产物，是由植物中的酚类物质所产生的，主要存在于皮、根、叶和果实中。蓝莓中有多种富含多酚的物质，如花色苷类、单宁类、黄酮类等，多酚还具有抗氧化以及抗炎作用，可有效预防心血管病、癌症等。由于对蓝莓多酚需求的逐渐增加，蓝莓多酚提取工艺技术的研究不断发展。目前，提取多酚的方法有多种，如溶剂提取法、超声波辅助法、微波提取法等，而采用酶法提取果渣多酚的报道并不多。在果渣中多酚多以聚合物的形式存
4、在，通常以糖苷键、氢键或疏水键与糖类、蛋白质、纤维素以及淀粉等结合，形成稳定的复合物。纤维素酶可以破坏和降解细胞壁中的纤维素和果胶，使蓝莓果渣中的植物细胞的原生质体和液泡由于细胞壁损失而被破坏，释放出多酚和其它活性物质，从而达到提取蓝莓果渣中多酚的目的。酶法提取不仅具有试验操作简单、提取条件温和的特点，还具有安全环保、营养素损失小的特点，从而可以有效降低提取温度、缩短提取时间，提高产物得率 。本研究利用纤维素酶较高的选择性和较强的特异性提取蓝莓果渣中的多酚，显著提高多酚的提取率，为蓝莓果渣的综合利用和加工开辟新的途径 。因此，本试验采用纤维素酶法提取蓝莓果渣中的多酚，对纤维素酶用量、提取初始、
5、料液比、提取时间、温度等因素进行探究，并且采用响应面分析法对各因素进行优化研究，以此确定最佳提取工艺条件。材料与方法供试材料干制蓝莓果渣（实验室自制）；福林酚（上海蓝季生物技术有限公司）；没食子酸（国药集团化学试剂有限公司）；纤维素酶（国药集团化学试剂有限公司）；无水碳酸钠，盐酸（，国药集团化学试剂有限公司）。试验仪器 型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；型低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；型 计（梅特勒托利多仪器有限公司）。测定项目及分析方法多酚标准曲线绘制在范围（的体积梯度）内准确吸收没食子酸标准溶液，加入福林酚试剂，混匀，室温静置 ，加入 溶液后定容摇匀，室温暗处放置后，在波长 下
6、，以没加标准液的溶液作为空白对照，测定吸光度。多酚含量测定将蓝莓果渣离心后得到的上清液，测其体积并稀释，取样品溶液置于体积为 的容量瓶中，每组做个平行试验，测定样品中的吸光度，建立标准曲线，计算样品溶液中的多酚含量和多酚得率。提取蓝莓果渣多酚的工艺流程将蓝莓渣 烘干，粉碎过筛保存。称取一定量的蓝莓渣粉，蒸馏水溶解加入纤维素酶恒温水浴，离心取上清液。多酚提取工艺的单因素试验称取蓝莓果渣，置于 三角瓶中，考察提取时间（、）、料液比（、）、酶用量（、）、初始（、）和温度（、）等种因素的影响，分别进行单因素试验，测定多酚的得率。安徽科技学院学报 年多酚提取工艺的响应面试验根据单因素试验结果，利用响应面
7、分析软件设计以料液比、酶用量作为考察因素，进行蓝莓果渣多酚提取的优化组合。各因素水平的设计见表。表响应面试验因素水平 水平液料比（）纤维素酶用量（）结果与分析多酚标准曲线的绘制以没食子酸的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图所示，标准曲线方程为 ，。提取时间对多酚得率的影响由图所示，在内，随着提取时间的延长，多酚得率逐渐上升；当提取时间达到时，多酚得率得到最大值，为（）；当提取时间超过，多酚得率开始缓慢下降，因为提取时间过长，温度会对多酚的分子结构产生破坏，促使多酚发生氧化或者降解等不可逆的化学反应，导致其含量降低。由图可知，当提取时间超过，蓝莓多酚含量没有明显的降低，可知提取时
8、间对多酚提取的影响较小，因此提取时间不作为考察因素，在响应面试验中固定提取时间为。图多酚含量的标准曲线 图提取时间对多酚得率的影响 料液比对多酚得率的影响由图所示，当料液比在 时，蓝莓果渣中的多酚含量逐渐增多；当料液比为 时，多酚的得率最大，为（）；这是当在溶剂用量达一定程度时，多酚的溶出接近饱和，提取量不会随料液比的增大而增加；当料液比大于 时，多酚得率逐渐下降，因为当溶剂的用大时，体系在振荡过程中会增加溶剂的含氧量，导致多酚被氧化，同时扩散到溶剂里的多酚类化合物越多，吸附作用增强导致多酚含量降低，而且从经济角度考虑料液比增大会提高提取剂成本。酶用量对多酚得率的影响由图所示，纤维素酶用量逐步
9、增加，蓝莓渣中的多酚得率先增加至最大值后缓慢降低，当纤维素酶用量为 时，多酚得率达到最高，为（）；当纤维素酶用量大于 时，多酚得率开始下降。这是因为纤维素酶的作用，会加快破坏细胞壁的结构，从而促进了蓝莓果渣中细胞内多酚类物质的释放，但是当纤维素酶的数量达到一定数值后，酶水解的底物达到饱和，过量的酶分子会聚集在细胞第 卷第期王大全，等：响应面优化酶法提取蓝莓果渣多酚工艺研究周围，进而影响多酚类物质的扩散，造成多酚得率的降低。因此，纤维素酶最佳用量为。图料液比对多酚得率的影响 图酶用量对多酚得率的影响 初始 对多酚得率的影响由图所示，当初始 位于时，蓝莓果渣中的多酚得率随着 的增大而显著提高，当初
10、始 为时，蓝莓果渣中的多酚得率最大，为（）；当初始 大于时，随着 的增加，蓝莓渣中多酚的含量开始下降。这主要是由于初始 为时纤维素酶的活性大，当初始 较高或较低时，酶活性会受到影响，降低纤维素酶的酶解效率，从而造成蓝莓果渣中多酚含量的下降。因此，得出试验中初始 为为宜。提取温度对多酚得率的影响由图所示，当提取温度在 下，蓝莓果渣中的多酚得率逐渐升高；当提取温度达到 时，蓝莓果渣多酚得率达到最高，为（）；当提取温度超过 时，蓝莓果渣中的多酚得率呈缓慢下降趋势。考虑到纤维素酶的最佳温度和试验成本，选择提取温度为 比较适宜。当温度超过，蓝莓多酚含量没有明显的降低，因此提取温度不作为考察因素，在响应面
11、试验中固定提取温度为。图初始 对多酚得率的影响 图提取温度对多酚得率的影响 响应面试验结果分析响应面设计采用 软件，利用 中心设计原理，以蓝莓果渣中的多酚得率作为响应值，在单因素试验的基础上选择对多酚含量影响较大的个因素（液料比）、（）、（酶用量）进行响应面设计，进行三因素三水平的 中心组合设计，结果如表所示。安徽科技学院学报 年表响应面设计及试验结果 标准序号运行序号因素：液料比（）：酶用量（）多酚得率（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）
12、（）（）（）（）回归方程的确定和方差分析通过响应面分析软件对表中的试验数据进行分析，得到蓝莓果渣多酚得率（）的二次多项拟合方程：.。对回归模拟进行方差分析，由表可知，说明试验中采用的回归模拟是极其显著的。失拟项 大于，即失拟项是不显著的，说明方程拟合的较好。因此，可以用该模型代替试验实际操作对试验结果进行预测。由表可以看出，其中（酶用量）在试验研究过程中对多酚得率的影响是极显著的，（液料比）对多酚得率的影响是显著的，只有（）是不显著的，而在交互项和二次项中的各项均是极显著的。另外由各因素的值大小可以看出，对响应值多酚得率影响最大的是纤维素酶的用量，其次是料液比，最后是。表响应面试验方差分析 来
13、源平方和自由度均方值值显著性模型 液料比 酶用量 残差 失拟项 纯误差 总和 响应面最佳工艺条件的确定根据单因素试验结果，选择合适的试验数据，分析料液比（）、（）、酶用量（）对蓝莓果渣中多酚得率的影响，并作出 、的响应面分析图及等高图。由图可以看出，蓝莓果渣中多酚得率在料液比为、初始 为时达到最大值。从响应面三维图可以看出，料液比的曲面变化比较大，说明料液比对多酚得率的影响比 大，这与方差分析结果相一致。第 卷第期王大全，等：响应面优化酶法提取蓝莓果渣多酚工艺研究由图 可知，响应面三维图中蓝莓果渣中多酚的得率随料液比和酶用量的变化都是先增加后降低，在料液比为，酶用量为 时，蓝莓果渣中多酚的得率
14、达到最高，分析等高线图可以发现，酶用量所在轴向的等高线较为密集，而料液比所在轴向的等高线较为稀疏，二者相比较，说明酶用量对多酚得率的影响更大。由图 可知，响应面三维图中蓝莓果渣中多酚的得率随着 和酶用量的变化都是先升高然后再降低。在初始 为，酶用量为 时蓝莓多酚得率达到最大。从等高线图可以发现，酶用量所在轴向的等高线更为密集，说明酶用量对多酚得率的影响较大，而 所在轴向的等高线相对稀疏，说明 对多酚得率的影响较小，这与方差分析的结果一致。而二者的等高线图的形状呈椭圆形，说明酶用量和 之间有显著交互作用。综上，果渣多酚提取的最佳工艺条件是料液比为 、为、酶用量为 ，在此条件下，蓝莓果渣中多酚得率
15、达到最高，为 。图与对多酚得率影响的响应面三维图 图与对多酚得率影响的响应面等高线 图与对多酚得率影响的响应面三维图 图 与对多酚得率影响的响应面等高线 图 与对多酚得率影响的响应面三维图 图 与对多酚得率影响的响应面等高线 安徽科技学院学报 年结论本研究获得蓝莓果渣中多酚最佳提取工艺（料液比为 、为、酶用量为），蓝莓果渣多酚得率为 。目前，提取蓝莓多酚的常用方法包括有机溶剂法、超声波辅助法、微波辅助提取法，有机溶剂法存在试剂残留、安全隐患问题，超声波辅助浸提和微波辅助浸提所用的设备技术和经济成本高，采用酶法提取的最大优势是反应条件温和，蓝莓多酚在提取过程中几乎不损失，有效成分的提取量高；同时
16、所得产物纯度、稳定性、活性均较高，且无污染。此外，酶法还具有缩短提取时间、降低能耗、降低生产成本等优势。考虑到实际操作过程的准确性，对此工艺进行进一步修改，修改后的工艺条件为：液料比为，为，酶用量为，浸提温度为，浸提时间为。在该工艺条件下，测得蓝莓果渣中多酚的得率为 。该工艺过程操作简单，得率较高，适合蓝莓果渣多酚提取的实际生产，可以提高蓝莓副产物的利用率。参考文献：李翔，曾智文蓝莓叶多酚减压提取工艺的优化设计研究化工管理，（）：安晓婷，王兴那，周涛，等响应曲面法优化蓝莓渣多酚提取工艺食品工业科技，（）：赵旭彤蓝莓加工废弃物中花青素提取纯化及抗氧化活性研究长春：吉林大学，迟恩忠 蓝莓原汁加工关键技术研究及货架期预测 凤阳：安徽科技学院，程安玮，杜方岭，王文亮，等 蓝莓叶中可萃取多酚 与 不 可 萃 取多酚提取 的研究 南 方 农 业 学 报，（）：王鑫，韩茜宇，薛宏坤，等 响应面法优化超高压提取蓝莓花色苷工艺及其活性研究 中国调味品，（）：徐青，周元敬，黄筑，等 蓝莓花青素的提取及分离研究进展 食品与生物技术学报，（）：阎海青，陈相艳，程安玮，等 超声微波联用技术提取蓝莓多酚的工艺优化
