1、doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.01.014基金项目:国 家自然科学基 金(82170606);中 原 科 技 创 新 领 军 人 才(214200510004);洛阳市科技计划项目(2101028A);洛阳市职业技术学院科研培育基金(SJPY202102)第一作者简介:张兵兵,硕士,检验师,研究方向:肝脏的损伤与修复。E-mail:bingbing939412 通讯作者:李三强,博士,教授,硕士生导师,研究方向:肝脏损伤与分子修复。E-mail:sanqiangli2001 小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 和大黄素对活化后肝星状
2、细胞增殖能力的影响张兵兵1,2,李三强1,2,王子仪1,2,苏梦尧1,2,洪晓敏1,2,罗仁利1,2,杨孟利1,2,郑润月1,2,王磊娜31.河南科技大学基础医学院肝脏损伤与修复分子医学重点实验室,河南 洛阳 471000;2.河南省肝病防治工程技术研究中心;3.洛阳市职业技术学院【摘要】目的探讨小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 和大黄素对活化后肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)增殖能力的影响。方法将大鼠 HSC-T6 细胞用含酒精的培养基诱导 48 h 使其活化;然后配置小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A和大黄
3、素不同浓度梯度含 10%血清的 DMEM 培养基,分别培养活化后的 HSC-T6,观察 HSC-T6 细胞的形态,以 MTT 法观察细胞增殖能力的变化。结果MTT 结果显示,与对照组相比,小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 和大黄素均可抑制活化后 HSC 的增殖(P0.05),且抑制率呈浓度依赖关系。其中,(+)-Ainsliadimer A 抑制细胞增殖的能力最强。结论小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 和大黄素可能通过抑制活化的 HSC 增殖有效逆转酒精诱导的肝纤维化。【关键词】小白菊内酯;含笑内酯;(+)-Ainsliadimer A;大黄
4、素;肝星状细胞中图分类号:R575文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)01-0065-06收稿日期:2021-11-21The effects of parthenolide,micheliolide,(+)-Ainsliadimer A and emodin on prolif-eration of activated hepatic stellate cellsZHANG Bingbing1,2,LI Sanqiang1,2,WANG Ziyi1,2,SU Mengyao1,2,HONG Xiaomin1,2,LUO Renli1,2,YANG Mengli1,2,ZHE
5、NG Runyue1,2,WANG Leina31.The Molecular Medicine Key Laboratory of Liver Injury and Repair,Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000;2.Henan Center for Engineering and Technology Research on Prevention and Treat-ment of Liver Diseases;3.Luoyang Vocational Technical Co
6、llege,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of parthenolide,micheliolide,(+)-Ainsliadimer A and emodin on the proliferation of activated hepatic stellate cells(HSC).MethodsRats HSC-T6 cells were induced with the alcohol-containing medium for 48 hours to activate them.Then,the activated
7、HSC-T6 cells were cultured in DMEM medium containing 10%serum with different concentrations of parthenolide,micheliolide,(+)-Ainsliadimer A and emodin,re-spectively.The morphology of HSC-T6 cells was observed,and the proliferation of HSC-T6 cells was observed by MTT assay.ResultsThe results of MTT s
8、howed that the proliferation of activated HSC was inhibited by parthenolide,mich-eliolide,(+)-Ainsliadimer A and emodin compared with the control group(P0.05),and the inhibition rate was con-centration-dependent.Among them,the ability of inhibiting the proliferation cell by using(+)-Ainsliadimer A w
9、as the best.Conclusion Parthenolide,micheliolide,(+)-Ainsliadimer A and emodin may effectively reverse alcohol-induced liver fibrosis by inhibiting the proliferation of activated HSC.【Key words】Parthenolide;Micheliolide;(+)-Ainsliadimer A;Emodin;Hepatic stellate cells酒精性肝纤维化(alcoholic hepatic fibros
10、is,AHF)是由肝脏细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)各种成分的过度沉积及分布异常,从而导致纤维增生和纤维降解不平衡为主要的病理特征1-2。其中,一个非常重要的促进肝纤维化的因素是肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活,活化的 HSC 会产生大量的ECM,造成肝纤维化的发生。然而,通过抑制 HSC 的增殖来逆转肝纤维化已被广泛关注3。目前,针对 AHF 临床上尚无相应的靶向治疗手段,大多以戒酒、营养支持以及抗肝纤维化药物治疗为主4。小白菊内酯、含笑内酯是从中草药中获得的天然产物,具有原料丰富、毒性低、成药性好的优点5。有研究显示,小
11、白菊内酯、含笑内酯均可使肺纤维化得56胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1到改善6-7;(+)-Ainsliadimer A 可诱导各种癌细胞的死亡,并抑制体内肿瘤生长和内毒素介导的炎症反应8;大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌)是一种天然蒽醌类化合物,具有抗癌9、抗炎10、保肝11等多种生物活性12。刘理静等13发现,大黄素可以抑制肺成纤维细胞增殖及转化和胶原蛋白合成,使肺纤维化得到明 显 的 改 善。而 关 于 小 白 菊 内 酯、含 笑 内 酯、(+)-Ain
12、sliadimer A 和大黄素在肝脏中是否有相似的作用却未见报道。因此,本研究通过分析小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 和大黄素对体外活化的HSC 增殖的变化,探讨是否能够起到逆转肝纤维化的作用。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞:大鼠 HSC-T6 细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。1.1.2药物与试剂:小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 由河南科技大学化工学院实验室提供,纯度为 99.5%,小白菊内酯、含笑内酯由无水乙醇溶解,小白菊内酯储存液浓度为 200 mmol/L,含笑内酯储存液浓度均为 100 mmol/L,再由细胞培养液
13、DMEM稀释至所需浓度,同体积的无水乙醇加入 DMEM 作为对照;(+)-Ainsliadimer A 由 DMSO 溶解,储存液的浓度为 100 mmol/L,再由细胞培养液 DMEM 稀释至所需浓度,同体积的 DMSO 加入 DMEM 作为对照。大黄素购自 Selleck 公司(货号:S229503),纯度为 99.75%,由DMSO 溶解,储存液的浓度为 100 mmol/L,再由细胞培养液 DMEM 稀释至所需浓度,同体积的 DMSO 加入DMEM 作为对照。DMEM 高糖培养基购自 Gibco 公司(货号:12800017),胎牛血清购自杭州四季青生物公司(货号:11011-8611
14、),胰蛋白酶-EDTA 消化液购自索莱宝公司(货号:T1300),无水乙醇购自天津汇杭化工科技有 限公司(货号:20000617),四甲 基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自索莱宝公司(货号:M1020),二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)购自天津市大茂化学试剂厂(货号:2580)。1.1.3 主要仪器:CO2细胞培养箱(上海 STIK 公司),倒置显微镜(德国卡尔蔡司公司),负压吸引器(上海斯曼峰医疗器械公司),酶标仪(美国 BioTek 公司)。1.2实验方法 1.2.1细胞培养:使用含质量浓度为 100 g/L 胎牛
15、血清的 DMEM 培养基培养细胞,并将 HSC-T6 细胞置于饱和湿度、37 和体积分数为 5%的 CO2通用培养条件下培养,每日换液,待细胞生长密度为 80%90%时(约 3 d),进行细胞传代。1.2.2细胞传代:弃掉培养瓶中的培养液,用 PBS 洗3 遍,然后加入 1 ml 的质量浓度为 25 g/L 的胰蛋白酶消化液,十字交叉晃动培养瓶,使胰酶能充分消化所有的细胞,随后放入培养箱孵育 30 s,接着在倒置显微镜下观察细胞的形态,待细胞变圆后,迅速加入 2 ml 含质量浓度为 100 g/L 的胎牛血清的 DMEM 培养液终止消化,轻轻吹打使细胞团分散成单个细胞,按 12 或1 4 的比
16、例进行传代。1.2.3HSC 活化:将传代的细胞接种于无菌 6 cm 的培养皿中,使用含质量浓度为 100 g/L 胎牛血清的 DMEM 培养,待细胞全部贴壁后,弃掉培养液,加入含100 mmol/L 乙醇、含 10%血清的 DMEM 培养液,在饱和湿度、37 和体积分数为 5%的 CO2通用培养条件下培养 48 h,使 HSC 活化。1.2.4小白菊内酯、含笑内酯、(+)-Ainsliadimer A 和大黄素对细胞增殖能力的影响:取对数生长期活化的HSC-T6 细胞以每孔 100 l,小白菊内酯、含笑内酯和(+)-Ainsliadimer A 细胞数为 1105个/ml,大黄素细胞数为 5104个/ml 接种于 96 孔板中,普通 DMEM 培养基于 37 、体积分数为 5%的 CO2通用培养条件下培养 20 h,弃去上清液,向各孔分别加入 100 l 含有不同浓度的四种药物和 10%血清的 DMEM 培养液或无药的培养液(含最大药物浓度时的溶剂量 0.1%的溶剂)进行实验,每组设置 6 个平行复孔,并设置空白对照组。加入各浓度小白菊内酯、(+)-Ainsliadimer A培养
