1、中国现代医学杂志China Journal of Modern MedicineVol.33 No.7Apr.2023第 33 卷 第 7 期2023 年 4 月心肌缺血再灌注损伤模型复制方法的研究进展*赵元彬，胡龙龙，余作忠，陈洋，杨人强（南昌大学第二附属医院 心血管内科，江西 南昌 330006）摘要：复制心肌缺血再灌注损伤模型是进行心肌缺血再灌注损伤研究的基础，复制稳定且高效的动物和细胞模型尤为重要。目前，心肌缺血再灌注损伤模型分为结扎动物冠状动脉左前降支的在体模型、动物心脏灌流装置及细胞缺氧再灌注的离体模型，但在模型复制过程中仍存在成功率低、重复性差等问题。因此，该文结合近年研究对该模
2、型的复制和改良方法进行归纳和综述，为复制更为稳定的模型提供新的思路和方向。关键词：缺血性心脏病；心肌细胞；缺血再灌注损伤；缺氧/复氧；模型中图分类号：R542.2文献标识码：AResearch progress in establishing myocardial ischemia-reperfusion injury model*Zhao Yuan-bin,Hu Long-long,Yu Zuo-zhong,Chen Yang,Yang Ren-qiang(Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang
3、University,Nanchang,Jiangxi 330006,China)Abstract:The establishment of myocardial ischemia-reperfusion injury model is the basis of myocardial ischemia-reperfusion injury research.It is particularly important to establish stable and efficient animal and cell models.At present,myocardial ischemia-rep
4、erfusion injury model can be divided into in vivo model of ligation of animal anterior descending coronary artery,animal heart perfusion device and in vitro model of cell hypoxia reperfusion.However,there are still some problems in model construction,such as low success rate and poor repeatability.C
5、onsequently,this paper summarizes and reviews the construction and improvement methods of this model based on recent studies,providing new ideas and directions for the construction of a more stable model.Keywords:ischemic heart disease;myocardial;ischemia/reperfusion injury;hypoxia/reoxygenation;mod
6、el近年来，中国缺血性心脏病的患病率持续上升，并且超过癌症成为主要死因1。急性冠脉综合征作为最凶险的心血管疾病之一，中国专家共识建议实现早期血管再通，恢复心肌供血以减少心肌缺血坏死2。然而，缺血再灌注可能导致心肌进一步损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤3。心肌缺血再灌注损伤主要表现为再灌注性心律失常、心肌顿抑引起的心功能障碍及微血管闭塞引起的无复流4。目前，对心肌缺血再灌注损伤的防治尚缺乏有效治疗手段。因此，深入研究并阐明心肌缺血再灌注损伤的发病机制可以为其防治提供理论依据和研发方向。心肌缺血再灌注损伤的病理机制较为复杂，主要涉及氧自由基损伤、钙超载、炎症反应、细胞凋亡、补体激活、免疫失衡
7、、内质网应激、细胞自噬、铁自噬、心肌能量代谢紊乱、心肌微血综述DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2023.07.008文章编号：1005-8982（2023）07-0046-09收稿日期：2022-07-05*基金项目：国家自然科学基金（No：81960081）通信作者 杨人强，E-mail：；Tel：13979117790 46第 7 期赵元彬，等：心肌缺血再灌注损伤模型复制方法的研究进展管内皮细胞损伤等5。首先，缺氧阶段线粒体中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）和抗氧化剂产生减少，无氧代谢导致乳酸堆积引起代谢性酸中毒。其次，ATP生成
8、减少，细胞表面钠钾泵和钙泵功能障碍，离子交换通道失效，细胞中较高水平的钠会降低钠-氢交换泵的活性，内质网上的钙泵功能障碍，从而限制钙的再摄取。氢、钠、钙离子的积累导致细胞内高渗透压，使细胞肿胀，最终细胞质中的酶活性受损。再灌注阶段，缺血细胞中抗氧化剂浓度降低，活性氧（reactive oxygen species,ROS）浓度增加，线粒体损伤和免疫失衡并通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系统、一氧化氮合酶系统和黄嘌呤氧化酶系统促进氧化应激，导致心肌微血管内皮细胞损伤、脱氧核糖核酸损伤和局部炎症反应。最后，细胞损伤并通过自噬、凋亡、焦亡、坏死等途径致使细胞死亡6-7。目前，心肌缺血再灌注损伤的具
9、体病理机制仍不明确，也有学者表明，再灌注阶段由于受到缺血时期炎症反应的遗留作用导致心肌坏死边缘进一步扩大8。再灌注阶段NOD样受体热蛋白结构域相关 蛋 白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）的过表达和炎症小体活化，能促进细胞因子和其他炎症因子释放、破坏细胞膜、降低细胞渗透压，使细胞肿胀，引起细胞凋亡。在探究靶向药物的病理机制过程中，通过、期临床研究发现，白细胞介素-1 受体拮抗剂阿那白滞素有望在心肌缺血再灌注损伤中起积极作用9。因此，复制高效且稳定的动物或细胞缺血再灌注模型，深入探索其病理
10、机制，对进一步改善临床预后有重要意义。该文结合近5年的研究对心肌缺血再灌注损伤模型复制和改良的方法进行归纳和综述。1 动物缺血再灌注损伤模型的复制1.1动物种属选择当前动物模型种属复杂多样。用于心血管疾病研究的动物主要包括猪、比格犬、小鼠、大鼠及日本大耳白兔。其中，比格犬和猪因冠状动脉分布与人类有所不同而不被选择10。大鼠因其冠状动脉分布、血液循环系统与人类较为相似，且其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死表现早，模型复制的稳定性高、费用较低，常作为此类模型的首选11-12。其中，810周的成年SD大鼠肌肉和胸壁弹性较好，能提高实验操作成功率，被选择最多13。兔因心脏较大，便于手术操作，并且左右胸腔相
11、互独立，暴露心脏时不需要使用呼吸机，便于手术操作等优点被广泛应用于体内及体外模型14。近年来，树鼩因与灵长类动物的遗传关系比啮齿动物更密切，且体型小，繁殖容易，逐渐成为复制心血管疾病模型的理想动物15。1.2方法选择阻 断 动 物 冠 状 动 脉 左 前 降 支（left anterior descending branch,LAD）后又再通是目前模拟人类心肌缺血再灌注损伤的经典动物模型复制方法。研究目的和实验条件不同而选择各异。根据是否离体分为心脏在体结扎模型和心脏离体灌流装置模型；心脏在体结扎模型从解剖位置上又可分为胸外结扎法及心脏原位结扎法13，16。胸外结扎法因需要多次牵拉心脏，操作过
12、程中容易影响心脏的电活动和循环功能，模型成功率低，因此该方法正被逐步淘汰。常规的原位结扎可保持心脏处于正常解剖位置，对术后动物的心脏生理功能影响较小，可延长术后动物的存活时间，适合用于慢性再灌注的实验研究11，17。在此基础上，具体操作可分为垫管法和推管法。垫管法是将丝线或乳胶管等物质放置在心脏表面与LAD 一起结扎，此方法在缺血后不用剪断结扎线，可直接取出垫物恢复冠状动脉的血供，具有创伤小、手术时间短、操作相对简单等优点而被广泛应用18。传统的推管法因缺血效果不好，对心肌有严重的机械损伤，因此逐渐被淘汰。LI等13将塑料管垫于 LAD 表面，再用丝线穿过一起结扎，此操作减轻了手术过程中的机械
13、损伤，提高了模型成功率。但此方法的缺点是手术视野小、心脏不易固定，结扎 LAD 时进针的位置及深度不易控制，对术者的熟练度要求较高。由于离体心脏不受神经、体液的调节，影响因素较少，可控性与重复性较强，同时可控灌流装置可满足复杂缺血模型及药效学实验研究需要，是心肌缺血再灌注形态、功能及电生理学研究的重 要 模 型19。1895 年，德 国 生 理 学 家 Oslar Langendorff 首次介绍离体心脏灌流实验，其基本原 47中国现代医学杂志第 33 卷 理在于主动脉逆行灌流含氧的 Krebs-Henseleit 重碳酸 盐 缓 冲 液，使 心 脏 维 持 营 养 保 持 跳 动。Lange
14、ndorff离体心脏灌流前负荷、后负荷、营养液成分、温度等均可调节，且对技术的要求相对较低，现今仍被广泛应用。因不受在体神经、体液调节等影响，体外模型在监测心脏收缩力、心率及药物效果评价方面有着显著优势，通过体外左心室插水囊或气囊，可以更稳定地监测心脏收缩力和心率，将不同浓度药物溶解于灌流液中可以更为直接地观察药物对其心脏功能的量-效关系16。Langendorff 离体心脏模型主要通过减少或停止缓冲液灌注和冠状动脉原位结扎来复制缺血模型20。Langendorff 系统也是分解心脏组织并获得原代心肌细胞的常用方法。将离体心脏连接到Lagendorff灌流装置，通过左心室灌流胶原酶消化后切碎过
15、滤分离获得心肌细胞21。LI 等22优化了此系统，使之与多重自然重力沉降相结合，进一步用更简便的方法提供更高质量的心肌细胞，但由于持续冠状动脉灌注导致的组织水肿及动物细胞与人体细胞形态学的差异等，使此系统存在一定局限性23。1.3术前准备与手术操作选择传统的术前准备包括仪器设备连接、手术器材准备、备皮、消毒、麻醉后气管插管。气管插管对于维持呼吸循环稳定及模型稳定性有重要意义，但气管切开后插管本身属于有创操作，手术时间长会导致脏器体表降温及脱水，且对实验器材及手术技能要求较高。有研究者结合先进的临床经验，使用小型气管内镜辅助气管插管以避免气管切开，更大程度减少动物损伤24。通过面罩供给异氟烷诱导
16、和维持麻醉方法，避免了气管插管，并且大鼠术后能快速恢复意识和自主行为，手术时间短、并发症少、围手术期死亡率低25。手术切口位置也是影响手术成功的重要因素。成年 SD 大鼠左侧 3、4 肋间正对结扎部位，心脏暴露良好，是理想的手术切口位置。结扎部位越高，发生恶性心律失常及心脏骤停可能性越大，因此结扎部位的选择也至关重要。李言明等26以冠状静脉定位LAD 并在冠状静脉主干动脉圆锥下 23 mm 处结扎，并对比更高结扎位置，发现前者减少了恶性心律失常等不良反应的发生，提升了模型成功率。另外，结扎线太细极易损伤心肌甚至导致血管离断，并且再灌注时缝线不易剪断，容易导致左心耳撕脱，然而结扎线太粗可导致定位不准确，因此6-0缝线更为合适25。1.4模型时间窗选择缺血和再灌注的时间长短均可明显影响模型的效果。受动物种属、术型选择、实验条件等多因素影响，模型时间窗也存在差异。首先，缺血时间不应少于15 min，研究表明，过短的缺血时间不会导致细胞死亡和心肌细胞结构的变化27。与细胞模型中时间跨度大不同，大多数文献对动物心肌缺血时间的选择都控制在 3060 min12，28-29，尤其是缺血30 min后
