1、 刘 锟，王健英，魏莉，等 法测定杜仲皮、叶、雄花中 种成分 中成药，（）：，；：王水华，陈帮明，刘永芳，等 养阴益肾颗粒对糖皮质激素致肾阴虚证大鼠 轴的影响 中国实验方剂学杂志，（）：张子怡，陈宝军，张 庆，等 肾阳虚证动物模型的造模方法与评价指标 福建中医药，（）：赵红艳，倪育淳，白崇智，等 调经助孕胶囊对环磷酰胺化疗大鼠性激素及、的影响 中医临床研究，（）：江明，陈扬荣 慢支肺脾肾虚证型与血浆环核苷酸 和 关系的探讨 福建中医学院学报，（）：王方圆，谢 超，程蔚蔚，等 环磷酰胺化疗导致小鼠卵巢功能损伤模型的建立 上海交通大学学报（医学版），（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科
2、学基金（；）；江西省自然科学基金（；）；江西省教育厅科技计划项目（）；江西省卫生健康委员会科技计划项目（）作者简介：刘素萍（），女（汉族），江西吉安人，江西中医药大学科研助理，硕士学位，主要从事方剂作用机理及药效物质基础研究工作通讯作者简介：王海燕（），女（汉族），四川南充人，江西中医药大学讲师，博士学位，主要从事炎症性肠病中医药治疗与作用机制研究工作通讯作者简介：左铮云（），男（汉族），江西永新人，江西中医药大学教授，博士研究生导师，硕士学位，主要从事方剂配伍与现代药理研究工作四神丸对脾肾阳虚型结肠炎小鼠树突状细胞表面共刺激分子的调控作用刘素萍，葛 巍，程绍民，袁望圆，赵海梅，刘端勇，王海燕
3、，左铮云（江西中医药大学方 证研究中心，江西 南昌；江西中医药大学附属医院，江西 南昌；江西中医药大学中医学院 江西 南昌；江西中医药大学研究生院 江西 南昌）摘要：目的 探讨四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎（）小鼠树突状细胞表面共刺激分子的调控作用。方法 将 雄性小鼠随机均分为正常组、正常小鼠加用四神丸组（）、模型组、四神丸组（），每组 只。除正常组和正常小鼠加用四神丸组外，其余各组小鼠采用葡聚糖硫酸钠（）肌肉注射氢化可的松 大黄灌胃法建立脾肾阳虚型结肠炎小鼠模型。第 天按照相应剂量灌胃给药，每日 次，连续给药 。每天称小鼠体质量并观察小鼠的一般情况变化，采集新鲜的血液，提取血清，检测、指标；
4、测定小鼠结肠重量、结肠长度、计算结肠和脾脏的质量指数；采用 染色法进行结肠组织病理学观察；采用流式细胞术检测小鼠脾脏树突状细胞，的表达；方法检测小鼠结肠组织内，蛋白表达。结果 与模型组比较，四神丸组小鼠体质量增加，评分下降，结肠重量，单位结肠长度，肠重指数降低，结肠长度恢复，结肠组织，蛋白表达均明显下降（）；树突状细胞表面共刺激分子，表达水平显著下降（，），表达水平显著升高（）。结论 四神丸有效治疗脾肾阳虚型 小鼠可能是与调节树突状细胞表面共刺激分子的水平有关。关键词：四神丸；脾肾阳虚；溃疡性结肠炎；树突状细胞；表面共刺激分子 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）溃疡性结肠炎（，）是一
5、种发生在直肠和结肠的慢性非特异性炎症性疾病，目前认为导致肠道炎症发生、发展和转归的直接原因是肠道黏膜免疫反应的激活。近年来，树突状细胞（，）在急慢性炎症或免疫紊乱中的作用逐渐受到人们关注。是机体功能最强的专职抗原呈递细胞，其表面共刺激分子在树突状细胞分化、成熟和功能过程中发挥重要作用，并且有证据表明 在 的诱导和维持中扮演举足轻重的角色，。四神丸出自普济本事方，涵盖肉豆蔻，补骨脂，五味子，吴茱萸，大枣去核，生姜 味中药，具有温肾散寒，涩肠止泻的功效，临床常用于 脾肾阳虚之证。药理研究表明，四神丸可有效改善脾肾阳虚型 小鼠的症状，修复肠黏膜的损伤，降低 的复发率，具有调控 的工作基础。然有关四神
6、丸对 的调节机制尚不明确，故本研究拟采用流式细胞术，观察小鼠脾脏 表面共刺激分子的表达的影响，探讨四神丸治疗脾肾阳虚型 的作用机制。材料与仪器 动动物物 雄性小鼠 只，周龄 周，体重（），购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：（湘）。本实验获得江西中医药大学实验动物伦理会批准（动物伦理委员会编号），符合中国伦理委员会指导原则。小鼠置于清洁型动物房适应性饲养，自由饮水，饲固体饲料。药药物物及及试试剂剂（分子量：美国 公司，批号：）；四神丸（北京同仁堂天然药物（唐山）有限公司，批号）；大黄颗粒（广东一方制药有限公司，批号）；氢化可的松（河南润弘制药股份有限公司，国药准字）；便隐血（
7、）试剂（珠海贝索生物技术有限公司，批号）；苏木素 伊红（）染液（南京建成科技有限公司，批号）；，（英国 公司，批号分别是时珍国医国药 年第 卷第 期 ，），（美国 公司，批号分别是，）。仪仪器器 正置荧光显微镜，型石蜡包埋机，型石蜡切片机（德国 公司）；低温高速冷冻离心机（德国 公司）；型流式细胞仪（美国 公司）；凝胶成像分析仪（美国 公司）。方法 动动物物分分组组及及模模型型复复制制 适应性喂养 后，将 只小鼠随机分成正常组，正常小鼠加用四神丸组，模型组，四神丸组，每组 只。结合参考文献，建立脾肾阳虚型 小鼠模型，第一阶段复制“脾虚”模型：模型组和四神丸组小鼠灌胃大黄溶液，每只，连续灌胃，其
8、余各组小鼠灌胃等容积的蒸馏水；第二阶段复制“脾肾阳虚”模型：第 天在模型组和四神丸组小鼠臀部左右交替注射氢化可的松 （），同时予以（）溶液自由饮用，其余各组小鼠给予蒸馏水饮用，连续。在造模期间，小鼠出现泄泻脱肛，蜷缩扎堆，肛门血便，体质量减轻等症状，提示脾肾阳虚型 模型复制成功，。给给药药方方法法 脾肾阳虚型 小鼠造模成功后，依照人和动物间按体表面积折算的等效剂量，第 天正常小鼠加用四神丸组和四神丸组小鼠给予 四神丸混悬液灌胃，正常组和模型组给予等容积的蒸馏水灌胃。每日 次，连续给药 。一一般般情情况况观观察察 每日下午同一时间称重，记录小鼠的体质量，并同时观察小鼠的精神状态，毛发色泽，粪便粘
9、稠度，便血情况，死亡率等情况。血血清清 、测测定定 给药 后，对所有小鼠禁食不禁水，称其质量，用 戊巴比妥钠深度麻醉后，进行眼球取血，冰箱静置 ，分离血清取上清液，低温保存送至江西中医药大学附属医院进行指标检测。结结肠肠长长度度、质质量量、肠肠重重指指数数、单单位位长长度度结结肠肠质质量量、脾脾脏脏、脾脾重重指指数数测测定定 眼球取血成功后，处死小鼠，快速打开腹腔，分离肛门至回盲部的结肠和脾脏部分，小心剥离黏连的脂肪，将结肠组织自然展开平铺于冰袋上，测量长度并拍照记录。用预冷的磷酸盐缓冲液（）灌注肠腔清洗内容物，滤纸吸取多余的水分，称取结肠质量，计算：肠重指数（）结肠质量（）小鼠体质量（），单
10、位长度结肠质量 结肠质量（）结肠长度（）；迅速精确称取脾脏重量，计算：脾脏指数 脾脏重量（）小鼠体质量（），将脾脏快速转移至低温的 培养液中保存。结结肠肠组组织织病病理理形形态态学学观观察察 剪取距肛门 的 的结肠组织放入 的多聚甲醛溶液中固定 后，放入包埋盒中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切 厚的组织薄片，苏木素 伊红（）常规染色，中性树胶封片，通风处晾干后在光学显微镜下观察小鼠结肠组织形态和病理损伤情况。流流式式细细胞胞术术检检测测脾脾脏脏树树突突状状细细胞胞表表面面共共刺刺激激分分子子的的水水平平严格按照 公司抗体说明书步骤进行操作，检测小鼠脾细胞悬液中，细 胞 的 水 平。将
11、保 存 至 （批 号）培养液中的新鲜脾脏，在无菌培养皿中用无菌注射器温和研磨，过滤、轻柔冲洗，转移至离心管中，离心去上清，经 溶血素裂解处理后，使用 （批号）清洗细胞两次，弃上清，各管取 重悬细胞液，加入 的 （批号），封闭，计算需要的抗体总量，并按放大 倍进行稀释，制备抗体混合液，分别加入抗体混合液进行表染，室温避光孵育 ；加入 洗涤两次，以 离心 ；每管加入 均匀混匀，上流式细胞仪检测，并采用 软件分析结果。法法检检测测结结肠肠组组织织中中 ，蛋蛋白白表表达达 取已加入高效 裂解液，及 蛋白酶抑制剂的结肠组织匀浆液，于低温高速离心机，离心 ，取离心后上清液，采用 法测定蛋白浓度。根据目标蛋
12、白的分子量选择并制备相应的分离胶和浓缩胶，并根据总量 计算上样体积，严格按照产品说明书操作方法对蛋白进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育过夜、洗涤、二抗室温孵育、洗涤，超敏溶液：显影，暗室曝光，以 为内参，采用 图像处理软件计算对目标蛋白条带的灰度值于统计分析。统统计计学学方方法法 运用 及 统计软件进行数据统计分析，计量资料均以?表示，组间比较采用 检验，以 为差异有统计学意义。结果 四四神神丸丸对对脾脾肾肾阳阳虚虚型型 小小鼠鼠结结肠肠及及脾脾脏脏相相关关参参数数的的影影响响结果见表 和图。与正常组比较，模型组小鼠体质量显著下降，精神萎靡，反应迟钝，纳食减少，毛发粗糙，腹泻，便血，评分出现显著性
13、升高（），模型组小鼠结肠长度明显缩短（），小鼠结肠质量、肠重指数、脾重指数及单位长度结肠质量均明显升高（）；经四神丸治疗后，上述症状出现反转，小鼠体质量升高，精神状态良好，反应敏捷，食欲增加，毛发顺滑，腹泻及便血情况日渐好转，评分明显下降（）；各给药组的小鼠结肠长度明显延长（），结肠质量、肠重指数和脾重指数明显下降，单位长度结肠质量明显降低（）。表 四神丸对小鼠结肠长度、结肠质量、肠重指数、单位长度结肠质量、脾脏指数的影响（?）组别剂量 结肠长度 结肠重量 结肠重量指数单位长度结肠质量脾脏指数正常组 正常组 四神丸组 模型组 模型组 四神丸组 与正常组比较，；与模型组相比较：，图 四神丸对小鼠
14、 评分的影响（?，）四四神神丸丸对对脾脾肾肾阳阳虚虚型型 小小鼠鼠结结肠肠组组织织病病理理形形态态的的影影响响与正常组比较，模型组小鼠结肠黏膜明显受损，腺体排列紊乱，杯状细胞数量减少，溃疡形成，大量的炎性细胞浸润；与模型组比较，治疗组小鼠结肠黏膜趋于完整，炎性细胞浸润减少，无明显溃疡。结果表明，四神丸能够有效改善脾肾阳虚型 小鼠结肠黏膜的病理损伤。结果见图。四四神神丸丸对对脾脾肾肾阳阳虚虚型型 小小鼠鼠 、的的影影响响 与正常组比较，模型组小鼠血清中、的水平显著下降（，）；经四神丸治疗后，小鼠血清中、的水平明显升高（，）。结果表明四神丸可能通过降低、的水平来改善脾肾阳虚型结肠炎。结果见表。时珍
15、国医国药 年第 卷第 期图 四神丸对小鼠结肠黏膜组织病理形态的影响（染色，）四四神神丸丸对对脾脾肾肾阳阳虚虚型型 小小鼠鼠 细细胞胞表表面面活活性性分分子子的的影影响响 与正常组比较，模型组，水平显著降低（，），而，表达水平表达量明显升高（，）；与模型组比较，治疗组，表达水平显著增高（），而，表达量明显降低（，）。结果表明四神丸能够有效调节脾肾阳虚型结肠炎小鼠 细胞表面活性分子的表达水平。结果见表。表 四神丸对小鼠血清、的影响（?）组别剂量 正常组 正常组 四神丸组 模型组 正常组 四神丸组 与正常组比较，；与模型组相比较：，；表 四神丸对脾肾阳虚型结肠炎小鼠 细胞表面活性分子的影响（?）组别
16、正常组 正常组 四神丸组 模型组 模型组 四神丸组 与正常组比较，；与模型组相比较：，；四四神神丸丸对对脾脾肾肾阳阳虚虚型型 小小鼠鼠结结肠肠组组织织中中蛋蛋白白表表达达的的影影响响与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的，蛋白表达均明显升高（，）；经四神丸治疗后，蛋白表达水平明显下降（，）。结果见图。与正常组比较，；与模型组相比较：，图 四神丸对脾肾阳虚型结肠炎小鼠结肠组织中蛋白表达的影响（?）讨论溃疡性结肠炎（）是一种影响结肠的慢性炎性疾病，中医认为其归属于“痢疾”“久痢”“泄泻”等病范畴。病位主要在大肠，病机关键是脾虚，病情反复发作，迁延难愈的重要因素是脾肾阳虚，临床上常以四神丸加减治疗缓解期。研究表明，四神丸能改善肠黏膜的病理损伤，发挥对 小鼠的治疗作用。本研究发现四神丸可明显降低结肠质量、肠重指数及单位长度结肠质量，恢复结肠长度及小鼠血清、的水平，缓解结肠黏膜的损伤，提示四神丸对脾肾阳虚型 小鼠具有治疗作用。树突状细胞是一种专职抗原提呈细胞，是肠道黏膜系统内的重要成员，在启动免疫应答和诱导耐受过程中发挥重要作用。树突状细胞表面存在大量的分子，由于 之间失衡，树突状细胞表面共刺激分
