1、 南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：江苏省重点研发专项（）；国家自然科学基金项目（）作者简介：何晓娟，硕士研究生。通信作者：赵志刚，教授，研究方向为水稻遗传育种，：。何晓娟，万华，高俊文，等 水稻柱头外露率主效 的定位 南京农业大学学报，（）：，（）：水稻柱头外露率主效 的定位何晓娟，万华，高俊文，顾伟航，谢振威，赵志刚，万建民，（南京农业大学作物遗传与种质创新利用全国重点实验室，江苏 南京；中国农业科学院作物科学研究所，北京）摘要：目目的的 柱头外露率是杂交水稻制种的一个重要指标，本研究旨在检测控制水稻柱头外露率 及精细定位相关基因。方方法法 以低柱头外露率粳稻品种和高柱头外露率亲
2、本 配组的 群体进行 位点检测，在目标区域内利用分子标记筛选杂合单株，对连续自交获得的：和：群体进行多年稳定 位点定位，同时利用 技术对：群体进行柱头外露率 定位和候选基因序列分析。结结果果 相关性分析结果显示单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率这 个性状存在极显著的相关性。以总柱头外露率作为表型数据，利用已构建的覆盖全基因组分子连锁遗传图谱进行 定位，检测到第 和 染色体上的 个位点：和，选择贡献率大的 位点进行后续研究，该位点在：和：群体中被重复检测到。结合 测序结果，在 位点区间内筛选到 个存在差异的基因。结结论论 位点作为柱头外露相关的主效 位点，可进行后续的精细定位，筛选到的 个
3、候选基因有待进一步转基因功能验证。关键词：水稻；柱头外露率；异交结实率；定位；中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，）：（），：，：，：；水稻柱头位于雌蕊顶端，当水稻抽穗开花时，花药开裂，花粉落在柱头上完成双受精。水稻柱头外露是一个动态的过程，其主要受颖花的大小、开张角度及持续时间、柱头大小等因素影响。柱头外露率是衡量不育系异交优劣的重要指标，已有研究表明柱头外露率与制种产量存在显著的正相关关系。通过改善母本的柱头外露率，从而提高父母本的异交特性，是促进杂交水稻高产制种的关键技术，直接影响杂交稻制种产量。研究水稻柱头外露特性、筛选高柱头外露种质资源，定位和克隆控制水稻柱头外露基南 京
4、 农 业 大 学 学 报第 卷因对提高杂交稻制种产量具有重要的生产应用价值。在水稻栽培育种过程中，野生稻作为祖先种保留了很多水稻的原始特性，其柱头外露率高，柱头形态较栽培稻大和长，而栽培稻经过人工选择在花器官形态方面已经发生了很大程度的改变，异交率下降。不同种质的柱头外露率差异很大，对不同种质柱头外露率的筛选，可以为在杂交配组选择不育系时提供种质资源。应存山等为了筛选高柱头外露的水稻种质资源，考察了 份种质的柱头外露性状，柱头外露率从高到低的种质资源依次为斑点野生稻、长药野生稻、非洲栽培稻、巴蒂野生稻、杂草型、亚洲栽培稻。在亚洲栽培稻的 个亚种间，即籼、粳亚种间柱头外露率也存在较大差异，一般情
5、况下，籼稻的柱头外露率高于粳稻。目前对柱头外露率研究的遗传材料大多是野生稻和栽培稻籼稻，籼粳交或粳粳交的遗传材料研究还比较少。柱头外露是受多基因遗传控制的复杂数量性状，受多种外界因素影响。目前对控制柱头外露有关研究大多是数量性状位点（，）定位和分子标记辅助选择，在分离群体中利用 定位方法已经检测到多个数量性状位点。李晨等研究发现在野生稻栽培稻（东乡普野桂朝 号）的 群体，在第 和 染色体上分别定位到 个，其中来自东乡普野的位点表现出增效效应。等利用野生稻 和亚洲栽培稻 构建的重组自交系群体在第 和 染色体上定位到了影响柱头外露的，后者的表型贡献率较高，达。陈应南君等在构建的重组自交系群体中共检
6、测到 个与柱头外露有关的，分别是 个控制单柱头外露率、个控制双柱头外露率和 个控制总柱头外露率位点。苏晓梅利用日本晴和保持系 构建的 群体检测到 个控制单柱头外露率、个控制双柱头外露率和 个控制总柱头外露率的，并且 和 均定位在第 染色体上的标记 内，推测其为同一个位点。尹成等在 和 年对柱头单外露率和双外露率进行 定位，在第、和 染色体上共检测到 个影响柱头外露率的，年的结果都定位在第 染色体 和第 染色体 内。以上的研究结果显示控制柱头外露率的 分布在水稻的 条染色体上，但目前为止被克隆的影响柱头外露率的 较少，这表明柱头外露率性状的研究具有很大的挖掘潜力。近年来随着基因组测序技术的快速发
7、展，重要农艺性状 因测序技术的应用而得以精确定位，全基因组关联分析（，）最近也被用来鉴定与柱头外露有关的位点。等通过 分析出、和 通过调节控制水稻粒型进而影响柱头外露。基于集群分离分析（，）与测序法相结合的（）方法近年来也逐渐被应用于 位点的高效定位。是在 年由 等提出的，可用于具有相对性状的亲本杂交后产生的分离群体进行 位点检测，根据相反的性状值选择极端个体组成 个混池，每个池由 个个体组成，可成功鉴定农艺性状的。邓应德等在 年就利用类似于 原理的近等基因池的方法定位柱头外露的，将极低柱头外露和极高柱头外露的单株 等量混合，构成 个基因池，经多态性标记筛选后进行方差分析，在第、和 染色体上共
8、定位到 个与柱头外露连锁的。等结合 的批量分离分析，快速鉴定到 个抽穗期、个株高和 个穗长相关的，并在随机 群体或 群体中进行检测，进一步验证了 数据分析的可靠性。目前 应用在水稻柱头外露性状的研究还较少，柱头外露率是一个数量性状，利用传统的分子连锁图谱进行定位需要花费较大的人力和物力，而选择 方法可以高效鉴定全基因组上的位点，极大提高柱头外露率 定位的效率。本研究利用低柱头外露率粳稻品种作为轮回亲本，与高柱头外露率材料 杂交，对获得的、：及：遗传群体进行柱头外露性状调查统计，旨在检测稳定遗传的 位点并进行分子标记辅助选择育种，同时结合 分析技术进一步快速定位柱头外露率，为克隆水稻柱头外露率基
9、因奠定基础。材料与方法 供试材料本研究定位群体采用的材料为广亲和粳稻品种与高柱头外露率籼粳交中间亲本 经杂交和自交获得的 株 分离群体，以及在 定位区间内筛选的杂合单株再自交获得的 株 第 期何晓娟，等：水稻柱头外露率主效 的定位：和 株：群体。性状调查定位群体、：和：分别于、和 年夏季在南京农业大学土桥育种基地种植。在 月下旬至 月下旬水稻育性正常开花期开花量达整穗的 时，对亲本和分离群体单株随机剪取 穗并标记好编号，放置于 冰箱中防止柱头脱落及穗子发霉。统计每穗上半部分单柱头外露颖花数、双柱头外露颖花数和总柱头外露颖花数，并进行柱头外露率的计算，每株柱头外露率用平均值表示。单柱头外露率（，
10、）、双柱头外露率（，）和总柱头外露率（，）计算公式为：每穗上半部分单柱头外露颖花数 每穗上半部分总颖花数；每穗上半部分双柱头外露颖花数 每穗上半部分总颖花数；。连锁图谱的构建及 分析利用本实验室的 对 引物对亲本和 进行多态性分子标记筛选，共计筛选到 个覆盖水稻 条染色体的 标记。从 株 群体中选取 株低柱头外露率和 株高柱头外露率单株组成 母板，通过 公司的、（）、（）、和 等配套仪器进行 个 标记的基因型测定。结合基因型数据，采用 软件来构建全基因组分子连锁遗传图谱，取 阈值为 进行 位点计算。分析在：和：群体中各取 株高柱头外露率和低柱头外露率单株的叶片等量混池测序，以日本晴序列作为参考
11、基因组，进行高柱头外露率和低柱头外露率测序结果比较，筛选 指数（）极大或极小值区间。图 亲本和 植株形态和柱头外露表型.亲本（左）和（右）植株，比例尺为 ；单柱头外露颖花，比例尺为 ；双柱头外露颖花，比例尺为；、亲本（）和（）穗子，比例尺为 ；、亲本（）和（）穗子局部，比例尺为 。（）（），；，；，；、（）（），；、（）（），结果与分析 亲本及 群体柱头外露表型及统计分析亲本无柱头外露（图、），柱头外露率均为；亲本 为高柱头外露率籼粳交中间材料（图、），其单柱头外露率（图）为（），双柱头外露率（图）为（），总柱头外露率为（）（表）。群体的柱头单外露率、双外露率和总外露率均呈偏态分布（图），呈现
12、数量性状控制的特征，且三者的最高值均大于高值亲本（表），表现出超亲遗传现象。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷表 年亲本和 群体柱头外露率统计 性状 亲本 单柱头外露率 双柱头外露率 总柱头外露率 ：图 群体柱头外露率频数分布.红色箭头表示，橙色箭头表示。下同。对 群体的单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率三者之间进行相关性分析。结果显示，这 个性状间均有极显著正相关关系，表明三者可能相互影响或存在同一效应基因，均可以作为优异性状来表示水稻柱头外露率（表）。表 群体柱头外露率相关性分析 性状单柱头外露率 双柱头外露率 总柱头外露率 单柱头外露率 双柱头外露率 总柱头外露率 注：；：相同项
13、，无需进行相关性分析。下同。：；：，群体柱头外露率 定位相关性分析显示，单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率之间存在极显著正相关性，因此本研究以总柱头外露率作为主要性状进行 定位。利用 对在亲本和 之间具有多态性的 标记，通过软件 构建分子遗传连锁图谱，总长为 ，标记的平均距离约为 。根据 群体总柱头外露率检测到 个显著的 位点（和），分别位于第 和 染色体上，值为 和，贡献率分别为和，加性效应值为 和（表），均来自高柱头外露率亲本。由于 表现出极高的表型变异解释率，推测 可能是一个新的控制水稻柱头外露率的主效位点，因此将 作为目标区域进行分子标记筛选。表 群体检测到的 位点 群体染色体表
14、型贡献率 加性效应 标记区间 第 期何晓娟，等：水稻柱头外露率主效 的定位：及：群体柱头外露率表型及统计分析利用紧密连锁的分子标记筛选确定 位点基因型为杂合型，对排除 位点影响的单株进行自交繁种，得到：和：群体，以同样的方法对其单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率进行统计。结果显示，：和：群体中，单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率仍然呈数量性状连续分布且存在超亲遗传现象，单柱头外露率和总柱头外露率已趋于主效位点控制，外露率在逐渐增加（图 和图）。相关性分析显示单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率三者仍存在极显著正相关性（表）。图 ：群体柱头外露率频数分布.：图 ：群体柱头外露率频
15、数分布.：表 ：和：群体柱头外露率相关性分析 ：性状单柱头外露率 双柱头外露率 总柱头外露率 单柱头外露率 双柱头外露率 总柱头外露率 注：“”的左下角和右上角分别表示：和：的相关性系数。：“”：，：群体柱头外露率 定位及：群体 分析根据 年：群体的总柱头外露率数据，在全基因组进行 定位同样能够检测到 位点（图），值为，贡献率为。在 年：群体中同样以总柱头外露率为表型，构建高柱头南 京 农 业 大 学 学 报第 卷外露率和低柱头外露率 个极端池，对这 个池进行，测序结果显示，位点经过分子标记辅助选择之后，在：群体基因组已趋于纯合，位点仍然存在，并显示出更高的峰值（图）。图 遗传连锁图谱及检测到
16、的.紫色箭头表示 群体检测到的 位点，红色箭头表示：群体检测到的 位点。，：图 ：群体 分析.：置信区间；：置信区间。红色框线表示 位点。：；：定位区间候选基因分析根据 定位结果，位点在第 染色体 内。结果显示 位点附近存在多 个 具 有 差 异 的 基 因，对 区 间 内 可 能 具 有 差 异 的 所 有 基 因 进 行 序 列 分 析，发 现 和 在双亲间存在不同位置的 差异导致单个氨基酸发生变化。第 期何晓娟，等：水稻柱头外露率主效 的定位 在 网站（：）被注释为 ，在亲本 和 间 的 差 异 为 第 个 氨 基 酸 由 天 冬 氨 酸 转 变 为 甘 氨 酸（图）；在 网站被注释为 识别基序，在和 间存在 个氨基酸的差异，分别是第、和 位置的氨基酸不同（图）。这 个基因在水稻中均没有被报道过，相关研究也较少，具体功能还有待进行转基因试验确认。图 （）和（）在亲本间氨基酸差异分析.（）（）亲本和 的第 个氨基酸由天冬氨酸转变为甘氨酸；亲本和 的第、和 个氨基酸由精氨酸、脯氨酸、丝氨酸转变为组氨酸、丝氨酸、天冬氨酸。；，讨论单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率之间存在高度的相
