1、第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023人呼吸道合胞病毒 F 蛋白多肽免疫原性的初步研究胡宏俏1，2，李海2，黄星湖1，2，任虎2，江洁2，张亚楠2，3，宋晶晶2，郭宏2，时雨晴2，4，赵建楠2，张燕2，宋洋2*，许文波1，2*（1.安徽理工大学 医学院，淮南 232001；2.国家卫生健康委员会 医学病毒和病毒病重点实验室，中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，世界卫生组织西太平洋地区麻疹/风疹参比实验室，世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室，北京 102206；3
2、.北京中医药大学，北京 102206；4.山东第一医科大学，泰安 271000）摘要：人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus，hRSV）是引起全球婴幼儿下呼吸道感染的最主要病原体。hRSV 融合蛋白（Fusion protein，F）高度保守，是激发机体产生保护性抗体的主要靶向蛋白。目前，多种基于 F蛋白设计的 hRSV 疫苗处于三期临床试验阶段，但尚未批准上市。本研究基于 hRSV F 蛋白设计的 2条多肽 PA（F蛋白，aa216244）、PB（F 蛋白，aa110136），及其不同组合形式 PM（PA 和 PB 等量混合）、PL（PA 和 P
3、B 通过 Linker连接），分别通过肌肉注射和滴鼻免疫 BALB/c小鼠，评价多肽在小鼠体内的免疫效果。每只小鼠多肽的免疫剂量为 25 g，分别于第 0、14、28 d等剂量（加强）免疫一次。实验结果显示，与铝佐剂和 CpG 混合，多肽 PA、PB、PM 和PL 肌肉注射均能诱导小鼠产生高滴度结合抗体，降低肺脏病毒载量，其中 PB 免疫组小鼠在 hRSV 活病毒攻毒后，体重恢复时间及肺病毒载量降低程度优于 PM 和 PL免疫组和对照组；将多肽 PM 和 PL通过不同途径免疫小鼠，滴鼻免疫组小鼠体重恢复时间和肺脏病理损伤程度优于肌肉注射免疫组。结果证明单独一条肽免疫对小鼠产生的保护效果优于混合
4、肽或串联肽，且滴鼻免疫产生的保护效果优于肌肉注射免疫。因此有必要深入开展 hRSV 多肽疫苗临床前研究，为多肽疫苗研制奠定基础。关键词：人呼吸道合胞病毒；融合蛋白；多肽；疫苗中图分类号：R392.9 R373.1 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02034410DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004283人 呼 吸 道 合 胞 病 毒（Human respiratory syncytial virus，hRSV）是引起婴幼儿和老年人急性下呼吸道疾病（Acute lower respiratory tract illness，ALRI）重要的病原体
5、之一1，2。hRSV 属于肺炎病毒科（Pneumoviridae），正肺病毒属（Orthopneumovirus）3。目前仅有 1 个血清型，根据抗原性分为 A 亚型和 B 亚型。hRSV 基因组全长约15kb，包含 10种基因，可编码 11种蛋白，其中融合蛋白（Fusion protein，F）是位于病毒表面的 I 型黏膜糖蛋白，具有高度保守性和抗原性，是目前疫苗和抗体研发的主要靶向蛋白4。F 蛋白的前体蛋白 F0 由574 个氨基酸组成，经福林蛋白酶（Furin）酶切裂解为 F1、P27 和 F2 后，具有生物活性。F1 和 F2 通过二硫键可进一步形成融合前（PreF）或者融合后（Pos
6、tF）构象，其中 PreF 蛋白构象包含 6个中和抗体表位（、I、II、III、IV、V）5。人体终身可反复感染 hRSV6。因此研发安全有效的 hRSV 疫苗，防止易感群体因感染 hRSV 导致下呼吸道系统及其相关疾病，减少感染率、重症率和病死率是当务之急。目前进入临床阶段的疫苗有减毒活疫苗7、病毒载体疫苗8、亚单位疫苗、纳米颗粒疫苗9等。hRSV 主要是以黏膜感染侵入为主，鼻黏膜免疫球蛋白（Immunoglobulin A，IgA）保护性更好，Mills 等人研究表明与血清中和抗体相比，鼻咽部分泌的中和抗体与保护作用的相关性更好10。然而，针对病毒特异性 IgA 抗体的记忆 B 细胞反应在
7、感染 hRSV 后显著缺失这可能是 hRSV 能反复感染的原因之一。理想的 hRSV 疫苗可以诱导持久的病毒特异性黏膜 IgA 抗体和记忆 B 细胞，诱导产生黏膜 hRSV 特异性 IgA 抗体的疫苗预计比单独刺激全身体液免疫产生抗体的疫苗更有效11。hRSV 的大多数蛋白对于诱导保护性免疫是不必要的，反而可能引起一些超敏反应或疾病增强效收稿日期：20221029；接受日期：20230106作者简介：胡宏俏（1996），女，主要从事呼吸道合胞病毒多肽疫苗的研究，Email：通讯作者：宋洋（1991），女，助理研究员，主要从事肠道和呼吸道病毒的分子流行病学和免疫学等研究，Email：；许文波（1
8、963），男，研究员，主要从事病毒病原生物学、免疫学、分子流行病学等研究，Email：开放科学（OSID）2期胡宏俏，等.人呼吸道合胞病毒 F蛋白多肽免疫原性的初步研究应。如 福 尔 马 林 灭 活 RSV 疫 苗（Formalin inactivated respiratory syncytial virus，FIRSV）可降低死亡率与发病率，但诱导非保护性免疫的蛋白可能 引 起 机 体 的 超 敏 反 应 或 增 强 型 呼 吸 道 疾 病（Enhanced respiratory disease，ERD）12。研究表明由 大 量 分 化 的 体 液 免 疫 偏 向 型 辅 助 T 细 胞
9、（Thelper 2，Th2）以及非特异性抗体引起的 ERD，可能导致疫苗接种者再次感染 hRSV 后疾病加重甚至死亡13，14。与传统的疫苗相比，多肽（Peptide）疫苗组成简单、安全性高且易于生产。每条多肽由十几到几十个氨基酸组成，是包含不同抗原 B 细胞和（或）T 细胞特异性抗原表位的免疫原性肽分子，可靶向诱导宿主产生体液免疫和细胞免疫15，可有效避免导致机体超敏反应或增强型呼吸道疾病的蛋白区域。然而，多肽的分子量较小，免疫原性较弱，因此提高多肽免疫原性的方法有待探索，如搭配不同佐剂免疫、延长多肽序列等16。目前多肽疫苗技术已应用于多种预防病原体的疫苗研发中，如艾滋病病毒、丙型肝炎病毒
10、、疟疾、口蹄疫病毒、流感病毒等1721。其中基于 hRSV 小疏水（Small hydrophobic，SH）蛋白胞外结构域的一条以 B细胞表位多肽为主的呼吸道合胞病毒疫苗正在开展三期临床实验22。虽然此前已经研究出很多关于 hRSV F 蛋白中和抗体表位的单克隆抗体，但针对 hRSV F 蛋白多肽的功能性研究相对缺乏。本研究基于已有研究23和抗原表位预测技术，以 hRSV F蛋白为靶向蛋白，筛选出 2条多肽。为了增加其免疫原性，通过添加柔性 Linker（GG）将两条多肽连接成一条长肽。通过对比鼻黏膜免疫途径与肌肉注射免疫途径，评价其免疫途径对免疫原性的影响，为 hRSV多肽疫苗的进一步研究
11、奠定基础。材料与方法1 细胞及病毒 Hep2 细胞系购买于 ATCC；hRSVALong 毒株保存于本实验室。2 实验动物68周龄雌性 BALB/c小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，本次研究所涉及的动物实验已经由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所动物实验伦理委员会批准（编号：2022017）3 主要仪器与试剂实时定量荧光 PCR 仪购自美国 BioRad 公司；病毒核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；荧光定量 PCR 试剂盒 PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit购自日本 TAKAR 公司；辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（H+L）购买自中杉金桥。B 型
12、CpG 佐剂由华普生物技术有限公司提供，铝佐剂由禾大生物技术有限公司提供。多 肽 的 设 计 与 合 成：基 于 IEDB 预 测 结 果（http：/www.iedb.org/home_v3.php）及 文 献 报道2325，发现 Peptide A（PA：aa216244）可能是一条可以产生中和抗体的多肽，它位于 hRSV F 蛋白的F1 区 域。Peptide B（PB：aa110 136）即 P27，是hRSV 感染儿童和成人的免疫显性表位，已有研究表明其可以减少小鼠肺部病毒载量和肺病理损伤。Peptide L（PL）即 PA 和 PB 通过柔性 Linker（GG）连接合成的由 58
13、 个氨基酸组成的长肽。Peptide M（PM）即合成的 PA 与 PB 按同等剂量混合组成的混合肽。因此本实验共选取两条多肽 PA，PB，并搭配其不同组合形式 PL，PM，以评价其免疫原性（图1）。不 同 多 肽 的 合 成 序 列 如 下：PA（aa216244，NIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT），PB（aa110136，ELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKRR），PL（aa：ELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKRRGGNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT），均由丹港生物科技有限公司合成。融合前 F 蛋白（以下简称
14、 PreF）由本实验室保存26。4 小鼠免疫与攻毒将 45 只 68 周龄雌性 BALB/c 小鼠随机分成九组（每组 5只），分别在第 0、14、28 d进行采血并免疫（50 L/只），不同组别小鼠的免疫方案详见表 1，PreF 免疫组为阳性对照组，AL+CpG 免疫组为佐剂对照组，无菌纯水免疫组做为空白对照组。对于hRSV BALB/c 小鼠的攻毒剂量，我们实验室前期实验已经对其进行摸索，并建立了致死模型27。因此根据前期研究，选取适中且不致死的攻毒剂量（3105 PFU/只）以评价多肽的免疫原性。具体攻毒方案如下：第 35 d 使用异氟烷麻醉小鼠后进行滴鼻感染 hRSVALong 活病毒，
15、攻毒剂量为 3105 PFU/只，随后每日观察记录小鼠体重变化，攻毒后第 5 d处死，取肺脏组织。5 血清特异性 IgG抗体测定96孔酶标板每孔包被 4 g/L的多肽抗原 PA、345病 毒 学 报39卷PB、PL、PreF，于 4C 静置过夜，次日使用含有 3%BSA 的 PBS封闭 2 h，甩干备用。每孔加入 5倍梯度稀释的血清（首孔稀释度为 1：100），37C 孵育 1.5 h；加入 1：5 000 稀释辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG，37C孵育 1 h；加入 TMB（四甲基联苯胺）显色液，37C孵育 15 min；加入终止液后用酶标仪（450 nm 波长）测定各孔吸光度（OD值）。6
16、肺脏组织病毒核酸 Ct值及肺脏组织病理切片小鼠感染 5 d后用异氟烷麻醉处死，取其右侧肺脏组织，加入 2%DMEM 培 养 基 进 行 研 磨，取200 L 提 取 核 酸，使 用 实 时 定 量 荧 光 PCR（RTPCR）检测肺脏组织的 hRSV 的肺病毒载量；取其左侧肺脏组织用 4%多聚甲醛固定 24 h 后，经苏木精和伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色，检查组织切片的特征，包括肺泡炎、毛细支气管炎、血管周围和组织间隙的上皮细胞的浸润程度28。对单个小鼠的肺组织进行盲评，评价指标为：肺泡壁增厚程度、间质性肺泡炎、肺泡炎、细支气管炎；评分标准为：0分（正常，无病变），1分（轻度炎症），2 分（中度炎症），3 分（明显炎症），4 分（严重炎症）。7 统计学分析使用 Excel 软件进行数据整理，使用 Graphpad Prism 9.0 软件进行统计学分析和绘图，运用 Oneway ANOVA 计算组间差异是否存在统计学意义，P711.27711.27/注：抗原剂量为每条多肽 25 g，肌肉注射免疫组选用的佐剂为 50 g 氢氧化铝佐剂（AL（OH）3）或磷
