1、免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023癌症在这个世界上是主要公共卫生问题，癌症发病率在全球逐年攀升1。肝癌是世界上最常见的癌症死亡原因，是5种死亡率最高的癌症中唯一一种发病率每年都在增加的癌症2。预计在2025年，全球每年将有100多万人受到肝癌的影响3。手术 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0240-09；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230031溶瘤流感病毒联合PD-1抗体增强对肝癌的抗肿瘤活性研究于洪妤，杨鹏辉，孙芳，徐岩，杨豪，康毅敏，郝雷*摘要 目的 探讨重组溶
2、瘤流感病毒联合免疫检查点抑制剂PD-1抗体治疗肝癌的效果。方法 全面鉴定重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF，通过血凝实验、TCID50测定重组溶瘤流感病毒滴度；电镜观察病毒形态和病毒粒子大小及分布；利用H22肝癌荷瘤Balb/c小鼠模型，研究delNS1-GM-CSF联合PD-1抗体对肿瘤杀伤和T细胞浸润的影响。结果 重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF 的血凝效价2829。肝癌荷瘤Balb/c小鼠模型表明，重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF联合PD-1治疗组抑制肿瘤生长的能力显著强于单病毒组或单抗体组（P0.01）。重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF和PD-1联
3、合治疗组具有较强的杀伤肿瘤效果（P0.01）。免疫组化和H&E染色结果表明，联合治疗组小鼠肿瘤中T淋巴细胞较丰富，肿瘤坏死严重。结论 重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF联合PD-1抗体治疗可显著抑制肝癌细胞生长，增强体内抗肿瘤免疫应答。关键词 溶瘤病毒；PD-1；联合治疗；肝癌中图分类号 R392.12文献标识码 AAntitumor activity of recombinant oncolytic virus combined with PD-1 antibody against hepatocellular carcinomaYU Hongyu1,2,YANG Penghui2,
4、SUN Fang2,XU Yan2,YANG Hao2,KANG Yimin1,HAO Lei1,*1.School of Basic Medical Science,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China;2.Institute ofHepatobiliary Surgery,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048,China*Correspondence Author:HAO Lei,E-mail:Abstract This study was designed to inv
5、estigate the efficacy of recombinant oncolytic virus delNS1-GM-CSF combined with immune checkpoint inhibitor PD-1 in the treatment of hepatocellular carcinoma.Recombinantoncolytic virus(delNS1-GM-CSF)was identified and the titer of recombinant oncolytic virus(delNS1-GM-CSF)wasdetermined with hemaggl
6、utination test and TCID50.The morphology and particle size distribution of the virus wereobserved under electron microscope;the effect of delNS1-GM-CSF combined with PD-1 antibody on tumor killingand T cell infiltration were investigated by using a subcutaneous tumor bearing mouse model of H22 liver
7、 cancercells.Data showed that the hemagglutination titer of delNS1-GM-CSF was 28-29.In vivo experiments showed thatdelNS1-GM-CSF and PD-1 combined treatment group had stronger tumor growth inhibition ability than single virusor single antibody group(P0.01).It shows that the combined treat with delNS
8、1-GM-CSF and PD-1 antibody hasstrong antitumor activity(P0.01).Immunohistochemistry and HE staining showed that T lymphocytes were abundantin the tumor tissue of delNS1-GM-CSF combined PD-1 antibody treated-mice,and the tumor necrosis was severe.Taken together,combined treatment with delNS1-GM-CSF a
9、nd PD-1 antibody can significantly inhibit the growth ofhepatocellular carcinoma cells and enhance the anti-tumor immune response in vivo.Key words Oncolytic virus;PD-1 antibody;Combined therapy;Liver cancer基金项目：北京市自然科学基金（7202194）作者单位：010110呼和浩特，内蒙古医科大学基础医学院（于洪妤，康毅敏，郝 雷）；100048北京，解放军总医院肝胆胰外科医学部研究所（于
10、洪妤，杨鹏辉，孙 芳，徐 岩，杨 豪）*通信作者：郝 雷，E-mail：240免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023作为肝癌治疗的首要选择4，但也只适用于少部分患者。其他治疗手段还包括肝移植、放疗、微波和射频消融以及分子靶向治疗，但肝癌患者的5年生存率仍然较低。据估计，全球肝癌死亡率为0.085人5。因此，研究更有效的肝癌治疗策略势在必行。免疫检查点抑制剂的出现已成为肿瘤治疗领域的热点，在肿瘤领域中展现出一定的临床治疗效果6。程序性细胞死亡-1（PD-1）是T细胞表面表达的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白7-8。目前，
11、已批准上 市 的 PD-1 抗 体 有 6 种，如 navulisumab 和pambolizulizumi 等。PD-1 抗体可在多种癌症患者中产生持久的抗肿瘤反应，可用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌9、霍奇金淋巴瘤10等。然而，在目前的临床应用中，在所有这些适应症中，只对一些患者是有效的，大多数患者对PD-1阻断剂具有抵抗力，因此容易受到免疫耐受11，并且免疫检查点抑制剂耐受性一直是一个临床难题11。在这种情况下，我们需要通过改变免疫抑制肿瘤微环境来更好地激活效应T细胞，并进入肿瘤组织杀死肿瘤组织。溶瘤病毒是一种可以选择性感染肿瘤细胞的病毒，无限期复制、溶解、破坏肿瘤细胞并释放子代病毒颗粒，
12、而不会损害正常组织12。这样，溶瘤病毒可以进一步将肿瘤抗原暴露于抗原呈递细胞13。它通过自我扩增、感染和选择性杀伤肿瘤细胞以及诱导全身抗肿瘤免疫来实现抗肿瘤效果。先前的研究表明，溶瘤病毒在癌症治疗方面具有巨大潜力14-15。近年来，溶瘤病毒被认为能够作为载体携带外源基因进入肿瘤，从而改变肿瘤微环境16。携带编码免疫刺激分子的基因的改良溶瘤病毒可以通过溶瘤和免疫治疗的结合增强抗肿瘤效果。已经有一些新的溶瘤病毒在各种癌症模型中进行了评估，例如携带编码炎症细胞因子的基因的溶癌病毒，这些炎症细胞因子可以改变肿瘤微环境以增强抗肿瘤反应17。GM-CSF通过促进巨噬细胞的活性和数量来增强抗体依赖性细胞介导
13、的细胞毒性，还可以促进M1型巨噬细胞并增强其活性，逆转肿瘤微环境的免疫抑制，增强CD8+细胞毒性T细胞的活性以增强抗肿瘤作用18-19。研究发现，联合治疗可以更有效杀伤肿瘤组织20，所以我们提出溶瘤病毒与PD-1抗体联合应用。在课题组前期研究中，我们将外源性GM-CSF基因片段插入甲型流感病毒A/PR/8/34（PR8）中，命名为delNS1-GM-CSF21。结果显示，该重组溶瘤病毒体内外实验初步证实该病毒可抑制肿瘤生长。本课题组利用反向遗传学技术将外源基因GM-CSF片段插入PR8流感病毒的NS片段，刺激机体产生有效的免疫反应，同时表达GM-CSF蛋白，改变肿瘤微环境，发挥抗肿瘤作用。本研
14、究将重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF与PD-1联合应用，以增强肝癌的治疗效果。1材料与方法1.1细胞、病毒、动物、鸡胚犬肾细胞MDCK购自中国科学院上海生命科学研究所；小鼠H22肝癌细胞购买自American Type Culture Collection 细胞库，流感病毒 A/PR/8/34（PR8）和重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF均本实验室保存。SPF鸡胚购自北京勃林格海威特生物技术有限公司；裸鼠（68周）和雌性Balb/c小鼠（68周）购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。1.2主要试剂及仪器胰蛋白酶、DMEM培养基购自美国Gibco公司；反转录所用试剂盒购买于北京全
15、 式 金 生 物 技 术 股 份 有 限 公 司；Trizol 购 自Invitrogen公司；huGM-CSF抗体ELISA检测试剂盒购自达科为生物技术有限公司；抗鼠PD-1抗体购自BioXcell公司（BioXcell,BE0273）；扫描电镜购自荷兰Phenom公司（日立HT7700）；酶联免疫分析仪购自美国Thermo公司。1.3重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF的鉴定1.3.1血凝试验将重组溶瘤流感病毒 delNS1-GM-CSF和流感病毒PR8接种到9日龄鸡胚中，鸡胚接种200l/枚，放入37培养箱中培养72h，将鸡胚转移到-4过夜，收集鸡胚尿囊液，对其测定血凝效价。1.3
16、.2病毒浓缩纯化分别将重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF和流感病毒PR8按1:1 000倍稀释后接种911日龄鸡胚。72 h后收集阳性尿囊液，4 000 r/min离心25 min，弃沉淀，上清32 000 r/min离心2 h，弃上清，沉淀用PBS重悬后，经30%和60%的蔗糖梯度离心，32 000 r/min 离心4 h，吸取病毒带，PBS洗脱，32 000 r/min，离心2 h，获得纯化后的重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF和流感病毒PR8。1.3.3RT-PCR鉴定采用Trizol法提取重组溶瘤流 感 病 毒 delNS1-GM-CSF 的 RNA，反 转 录 成cDNA，并用PR8流感病毒NS通用引物扩增片段。241免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023用琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并以PR8病毒骨架PHW198-NS作为对照。1.3.4电镜观察重组溶瘤流感病毒delNS1-GM-CSF以1:5 000倍稀释，接种9日龄鸡胚，0.2 ml/枚。培养72 h后，收集阳性鸡胚尿囊液
