1、化工学报 2023年 第74卷 第6期|,2023,74(6):2580-2588 CIESC Journal玻璃内包材界面修饰对机械应力诱导的单克隆抗体聚集体形成的影响王新悦1，王俊杰1，曹思贤1，王翠1，李灵坤1，吴宏宇1，韩静2，吴昊1（1 沈阳药科大学制药工程学院，辽宁 沈阳 110179；2 沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院，辽宁 沈阳 110179）摘要：利用十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS）对中硼硅玻璃管制注射剂瓶内表面进行化学改性，使用接触角仪（水接触角从 501增加至 902）、原子力显微镜（表面粗糙度从 0.4480.086 增加至
2、 1.2820.117）、红外（出现CH2和CH3特征峰）对表面进行验证，成功制备了具有疏水性能的玻璃表面。给玻璃瓶中的单克隆抗体施加机械应力，使用微流成像技术、尺寸排阻-高效液相色谱法（size exclusion-high performance liquid chromatography，SE-HPLC）、外源荧光对单抗制剂的稳定性进行全面表征。结果表明，OTS处理的疏水性界面可以减少机械应力诱导的蛋白质聚集体的产生。由于疏水表面与蛋白质强的疏水相互作用，OTS处理的疏水表面可有效抑制机械应力诱导的抗体分子的聚集。关键词：表面化学；内包材；吸附；抗体；聚集中图分类号：TQ 464.9 文
3、献标志码：A文章编号：0438-1157（2023）06-2580-09Effect of glass primary container surface modification on monoclonal antibody aggregates induced by mechanical stressWANG Xinyue1,WANG Junjie1,CAO Sixian1,WANG Cui1,LI Lingkun1,WU Hongyu1,HAN Jing2,WU Hao1(1 School of Pharmaceutical Engineering,Shenyang Pharmaceut
4、ical University,Liaoning 110179,Shenyang,China;2School of Functional Food and Wine,Shenyang Pharmaceutical University,Liaoning 110179,Shenyang,China)Abstract:The inner surface of middle borosilicate glass tubing was modified by octadecyltrichlorosilane(OTS).The contact angles of modified surfaces wh
5、ich were measured by contact angle goniometer increased from 501 to 902.The surface roughness which was measured by atomic force microscope increased from 0.4480.086 to 1.2820.117,and the result of Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)indicated that the OTS was successfully coated on the gla
6、ss surfaces.The monoclonal antibody in glass containers were subjected to mechanical stress.Microflow imaging,size exclusion-high performance liquid chromatography(SE-HPLC)and extrinsic fluorescence dye were used to characterize the stability of monoclonal antibody.The results showed that the OTS-tr
7、eated hydrophobic interface could reduce the generation of mechanical stress-induced protein aggregates.Due to the strong hydrophobic interaction between hydrophobic surface and protein,the hydrophobic surface could effectively reduce the aggregation of antibody molecules induced by mechanical stres
8、s.DOI：10.11949/0438-1157.20230201收稿日期：2023-03-07 修回日期：2023-05-08通信作者：吴昊（1990），男，博士，副教授，第一作者：王新悦（1997），女，硕士研究生，基金项目：辽宁省科技厅省博士科研启动基金计划项目（2021-BS-131）引用本文：王新悦,王俊杰,曹思贤,王翠,李灵坤,吴宏宇,韩静,吴昊.玻璃内包材界面修饰对机械应力诱导的单克隆抗体聚集体形成的影响J.化工学报,2023,74(6):2580-2588Citation：WANG Xinyue,WANG Junjie,CAO Sixian,WANG Cui,LI Lingku
9、n,WU Hongyu,HAN Jing,WU Hao.Effect of glass primary container surface modification on monoclonal antibody aggregates induced by mechanical stressJ.CIESC Journal,2023,74(6):2580-2588研究论文第6期Key words:surface chemistry;primary container;absorption;antibody;aggregation引言单克隆抗体由于其优秀的靶向性和较小的副作用被广泛应用在临床治疗、疫
10、苗等领域1-2。然而，蛋白质是生物大分子，极容易受外界因素的影响而发生空间构象的改变，产生蛋白质聚集体和不溶性微粒3，它们的形成不仅会影响蛋白质药物的药效，还有可能引起严重的不良反应4-5。例如，在静脉输液中，较大的不溶性微粒可能引起血管堵塞、肉芽肿、肺动脉高压、过敏样和热源样反应等严重不良反应6，Joubert等7研究表明搅拌制备的单克隆抗体聚集体通过刺激TLR-2和TLR-4受体，诱导细胞因子的分泌引起免疫反应。美国药典（United States Pharmacopoeia，USP）及欧 洲 药 典（European Pharmacopeia，EP）2.9.19规定使用光遮蔽法测量的10
11、 m和25 m颗粒应分别保持在6000和600粒/容器以下8。所以有效控制和减少蛋白质聚集体和不溶性微粒的产生对药品的生产和管理过程非常重要。蛋白质制剂一般通过添加特殊辅料来提高稳定性。例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80是生物制剂中使用最广泛的表面活性剂，常被用于与蛋白质竞争吸附在界面上，从而可以显著减少蛋白质的吸附和聚集9-11。此外，Perevozchikova 等12通过改变蛋白质处方中的 pH和离子强度来调节蛋白质与玻璃表面之间的静电相互作用，从而减少蛋白质吸附和聚集。也有研究通过改变蛋白质直接接触的材料表面的性质来稳定蛋白质。例如，材料表面和蛋白质之间带有相同电荷时可以抑制蛋白质吸附1
12、3。Wu等14对柱塞泵不锈钢表面进行改性，发现带正电的 IVIG与带正电的泵表面接触时产生的蛋白质聚集体更少。Movafaghi等15对玻璃表面进行 PEG 化学修饰，增加玻璃表面的亲水性，减少蛋白质吸附，发现PEG修饰的表面可以减少由空化引起的IVIG聚集体的产生。以上减少蛋白质聚集的策略是从减少蛋白质吸附的角度进行的。蛋白质在表面的吸附是常见的现象，与表面接触时，很容易发生吸附作用导致蛋白质的空间构象发生改变，产生蛋白质聚集体12，如预填充式注射器中颗粒的形成与蛋白质分子在玻璃-硅油界面的吸附和解吸有关16。此外，在运输过程中，剪切力也是聚集体产生的诱因17-19，例如吸附在固-液-气三相
13、界面上的变性蛋白质在经历剪切应力时，容易从界面上脱附下来进入溶液中，进一步形成聚集体20。中硼硅酸盐玻璃制成的亲水注射瓶是抗体制剂较常见的储存容器21，与亲水表面相比，蛋白质更容易吸附在疏水表面上，如与亲水性的SiO2表面相比，mAb1和mAb2更容易吸附在聚苯乙烯和特氟龙疏水表面上，并且疏水性更强的mAb2在疏水表面上吸附更多22。但是也有研究表明，贻贝蛋白在疏水表面的吸附力约为 320 kJ/mol，在亲水表面的吸附力约为180 kJ/mol。疏水表面与贻贝蛋白质分子作用力更强，吸附在疏水表面上的贻贝蛋白质很难分离23。乳球蛋白在疏水表面上不可逆吸附的比例高于亲水表面，显示出乳球蛋白可以更
14、强地与疏水表面结合24。假设在运输过程中，吸附在疏水表面上的特定蛋白质难以脱附下来，那么疏水表面在一定程度上可以抵抗流体剪切力诱导的蛋白质聚集体的产生。而且蛋白质直接接触的材料很多都是疏水表面，如输液袋、注射器、过滤器滤膜25。所以研究疏水表面与稳定蛋白质的联系尤为重要。本文对中硼硅玻璃表面进行化学处理，成功制备了疏水性的玻璃表面，对在疏水性玻璃瓶中应激后的单抗制剂的稳定性进行全面研究，讨论了疏水表面在运输过程中对IgG2产生不溶性微粒的影响及其机制。研究结果将对深入研究在运输过程中，控制运输条件，疏水表面保护IgG2免受流体剪切力的影响具有重要的研究价值。1 实验材料和方法1.1 实验材料7
15、 ml中硼硅玻璃管制注射剂瓶，肖特药品包装（浙江）有限公司。单克隆抗体（简称单抗，IgG2，75 mg/ml）,中国食品药品检定研究所。山梨醇，石家庄瑞雪药业有限公司。醋酸钠、醋酸，湖南尔康药业有限公司。Tergazyme 酶，美国 Alconox 公司。4,4-二苯氨基-1,1-联萘-5,5-二磺酸二钾盐（Bis-ANS）、十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS，分析纯）、2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（BCA）、酒石酸钠，购自阿拉丁。98%H2SO4、H2O2、甲苯、乙2581第74卷化 工 学 报醇（分析纯），购自利安隆博。1.2 实验仪器微 流
16、成 像 仪（fluid imaging technologies,FIM,FlowCAM 8000），Yokogawa Fluid Imaging Technologies。多 功 能 酶 标 仪（Infinite F500），Tecan。原 子 力 显 微 镜（atomic force microscope,AFM,Dimension ICON），Bruker。带有衰减全反射(attenuated total refraction,ATR)附件的傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR,Nicolet iS 10），Thermo。全自动接触角测量仪（OCA20），Dataphysics。旋转混匀仪，力辰科技有限公司。高效液相色谱仪（Primaide），日立高新技术公 司。全 自 动 比 表 面 积 孔 隙 率 分 析 仪（BET，ASAP2460），美国麦克公司。油浴锅（DF-101S），巩义市予华仪器有限公司。高速离心机（H3-20K），可成仪器有限公司。微孔板恒温孵育器（ST60-4），杭州米欧仪器有限公司。1
