1、基础研究Journal of Hepato3,Jun.2023肝胆外科杂志2 0 2 3年6 月第31卷第3期224大黄素通过NF-kB-iNOS/COX-2信号通路治疗急性胰腺炎的作用机制研究王子孺，李贺【摘要】目的石研究大黄素对急性胰腺炎的抗炎治疗作用及相关机制。方法半将2 4只SPF大鼠随机分为假手术组（Sh a m 组）、蔗糖脂肪酸酯处理组（Z组）、模型组（AP组）和大黄素处理组（E组）,每组6 只。除Sham组外,每一个组中均须使用L-精氨酸制作急性胰腺炎模型,E组于造完模型后1h及6 h分别给予大黄素（6 0 mg/kg）腹腔注射治疗;Z组比照E组，腹腔注射等量的4%的蔗糖脂肪酸酯
2、溶液进行处理；造模实验期间每间隔2 h观察大鼠的一般情况，AP组造模12 h后处死大鼠，E组及Z组末次给药后12 h后处死大鼠,ELISA法检测大鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1、i NO S和COX-2,TBA法检测大鼠血清中SOD、M D A 含量；WesternBlot检测大鼠胰腺组织NF-kB蛋白的表达情况;HE染色法检测胰腺及周围组织中的细胞炎症情况。结果与Sham组相比,AP组大鼠一般情况明显变差，血清TNF-、I L-6 及IL-1指标升高（P0.05）,SO D 活性升高，MDA活性降低（P0.05）CO X-2 及iNOS显著升高（P0.05）;与AP组相比，大黄素处理组
3、中TNF-、I L-6 及IL-1指标明显降低（P0.05）,SO D 活性升高，MDA活性降低（P0.05）；CO X-2 及iNOS明显降低（P0.05）；与Sham组比较，AP组大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白表达水平显著增加（P0.05）；与AP组相比,E组NF-kB蛋白表达水平明显降低（P0.05）。结论大黄素可以通过NF-kB-iNOS/COX-2通路来控制胰腺炎症，从而达到治疗胰腺炎的效果。【关键词】急性胰腺炎；大黄素;NF-kB-iNOS;COX-2；炎性因子【中图分类号】R 659【文献标识码】A【文章编号】1006-4761(2023)03-0224-06the anti-in
4、flammatory and therapeutic effects of emodin on acute pancreatitis and its related mechanisms(WANG Zi-ru,LIHu.The Second Hospital of Anhui Medical University,Hefei230000,China)【A b s t r a c t Objective To study the anti-inflammatory and therapeutic effects of emodin on acute pancreatitis and its re
5、latedmechanisms.Method 24 SPF rats were randomly divided into sham surgery group(Sham group),sucrose fatty acid ester treatmentgroup(Z group),model group(AP group),and emodin treatment group(E group),with 6 rats in each group.Except for the Shamgroup,L-arginine was used to create an acute pancreatit
6、is model in each group.Group E received intraperitoneal injection of emodin(60mg/kg)1 hour and 6 hours after the model was established,respectively;Group Z was treated with intraperitoneal injection of anequal amount of 4%sucrose fatty acid ester solution compared to Group E;During the modeling expe
7、riment,the general condition ofthe rats was observed every 2 hours.After 12 hours of modeling in the AP group,the rats were euthanized.After 12 hours of the lastadministration in the E and Z groups,the rats were euthanized.The serum TNF-、IL-6、IL-1、i NO S a n d CO X-2 o f t h e r a t s w a s d e-tect
8、ed by ELISA method;TBA method was used to detect the content of SOD and MDA in rat serum;Western Blot detection of the ex-pression of NF-kB protein in rat pancreatic tissue;HE staining was used to detect cellular inflammation in the pancreas and surroundingtissues.Result Compared with the Sham group
9、,the general condition of rats in the AP group significantly deteriorated,with serumTNF-、IL-6 a n d IL-1 increased(P0.05),SOD activity increased,MDA activity decreased(P0.05),COX-2 and iNOS signifi-cantly increased(P0.05);Compared with the AP group,TNF in the emodin treated group-、IL-6 a n d IL-1 Th
10、e indicators sig-nificantly decreased(P0.05),SOD activity increased,and MDA activity decreased(P0.05);COX-2 and iNOS significantly de-creased(P0.05);Compared with Sham group,The expression level of NF-kB protein in AP group rats pancreatic tissue was signifi-cantly increased(P0.05);The expression le
11、vel of NF-kB protein in group E rats pancreatic tissue decreased significantly comparedto AP group(P 98%）购自北京索莱宝科技有限公司（批号：518-8 2-1）;L-精氨酸和蔗糖脂肪酸酯（批号：1119-34-2,IS9000）购自北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛（分析试剂）购自天津大茂化学试剂厂（批号：30 2-17-0）；10%多聚甲醛购自南昌玉露实验设备有限公司（批号2 2 0 6 0 7）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒购自武汉塞维利亚生物科技有限公司（批号G1005）；冰醋酸溶液（
12、分析纯，醋酸浓度99.5%）购自天津恒兴化学试剂有限公司（批号：6 4-19-7）；无水乙醇购自成都麦卡希化工有限公司（批号：6 4-17-5）；实验用NF-kB抗体和山羊抗小鼠二级抗体购自CST公司。肿瘤坏死因子（T NF-）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R2856c）、白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（批号：E-EL-R0015c）、白介素-1（IL-1)ELISA试剂盒（批号：E-EL-R0012c）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2/COX-2)ELISA试剂盒（编号：D731111）、诱导型一氧化氮合成酶（NOS2/iNOS）ELI
13、SA 试剂盒（编号：D731068）购于生工生物工程（上海）股份有限公司；总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1法）（批号：A001-3-2）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）（批号：A003-1-2）购于南京建成生物工程研究所有限公司。2方法2.1分组、造模与给药24只无特定病原体（SPF）的大鼠随机分为假手术组（Sh a m 组）、蔗糖脂肪酸酯处理组（Z组）、模型组（AP组）和大黄素处理组(E组）。每组6 只。除Sham组外，各组均采用L-精氨酸制作急性胰腺炎模型。大黄素组在模型建立后1小时和6 小时腹膜内注射大黄素（用4%蔗糖脂肪酸酯溶液制备）;Z组腹膜内注射相同量的4%
14、蔗糖脂肪酸酯。在造模期间，观察大鼠的一般生活状况。模型建立后12 小时处死大鼠。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测IL-6、I L-1、T NF-;以及COX-2和iNOS。酶标试剂盒检测总SOD、MDA含量，进行NF-kB蛋白表达的蛋白质印迹（WB）检测。苏木精-伊红（HE）用于胰腺染色。观察胰腺组织的炎症情况。2.2样本采集与处理AP组造模12 h后处死大鼠,E组及Z组末次给药后12 h后处死大鼠，处死前留取血液标本。于EP管中静置，然后以150 0 g低温离心10 min,吸取血清并分装于冻存管中，放-8 0 冰箱冻存，用于测定血清中炎症指标及其他生化指标；处死大鼠后留取大鼠胰腺组
15、织，用于后续测定蛋白表达情况及HE染色。2.3大鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1、i NO S和COX-2水平测定按照ELISA试剂盒方法进行操作，检测各组大鼠血清中TNF-、I L-6、I L-1、i NO S和COX-2水平，测定仪器为全自动血生化分析仪。2.4大鼠血清中SOD、M D A 水平测定按照酶标试剂盒方法进行操作，检测各组大鼠血清中SOD、M D A 水平2.5大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白含量采用WesternBlot检测大鼠胰腺组织中NF-kB蛋白含量：取胰腺组织，与组织蛋白提取液一起在组织匀浆机上匀浆，然后10 0 0 0 g离心10 min，收集组织上清液，采用二喹啉
16、甲酸（BCA)法对上清液中蛋白定量，然后将蛋白置于-8 0冰箱中保存，备用。取等量蛋白（2 5g）上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，采用半干转膜法转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，脂奶粉封闭后,用相应一抗(1：10 0 0)在4下孵育，振荡过夜；TBST液漂洗3遍，羊抗免二抗（1：5000）孵育1h;TBST液漂洗3遍，采用化学发光超敏显色试剂盒显影。以GAPDH为内参,ImageJ分析靶带和内部对照带的灰度值，计算NF-kB蛋白的相对表达。2.6HE染色观察胰腺组织病理变化取各组大鼠胰腺，以4%多聚甲醛固定48 h，蒸馏水洗涤，梯度乙醇脱水，制作组织蜡块，冰上预冷4m切片，二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇复水，使用苏木精和伊红染液分别染细胞核和细胞质，脱水、透明后中性树胶封片，镜下观察各Journal,Jun.2023226肝胆外科杂志2 0 2 3年6 月第31卷第3期组大鼠胰腺组织病理变化。2.7数据分析使用SPSS22.0进行数据分析。正态性检验采用Sha-piro-Wilk检验方法。用s来描述符合正态分布的连续变量，独立样本t检验被用来比较两组间的差异；P0.05时认为差异具有
