1、广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023赵浩航，康旭，黄子威，等.大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定J.广东海洋大学学报,2023,43(4):62-68.收稿日期：2023-03-13基金项目：深圳市可持续发展专项（KCXFZ20211020165547010）；深圳市科技计划（JCYJ20220530140813030）第一作者：赵浩航（1998），男，硕士研究生，研究方向为水生动物病害防控研究。E-mail:通信作者：鲁义善（1974），男，教授，研究方向为水产经
2、济动物病害防治。E-mail:大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定赵浩航1,2,3，康旭1，黄子威1,2,3，温依铭1,2,3，汪志文1,2,3，喻大鹏3，甘桢1,2,3，夏洪丽3，夏立群1,2,3，鲁义善1,2,3（1.广东海洋大学水产学院/2.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室,广东 湛江 524088；3.广东海洋大学深圳研究院/广东省水生动物健康评估工程技术研究中心/深圳市海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台，广东 深圳 518120）摘要：【目的】分离鉴定大口黑鲈（Micropterus salmoides）肠道益生菌，评估分离菌用作饲料添加剂的益生潜力。【方法】采集大口黑鲈肠
3、道样本，采用稀释涂布法分离细菌，经16S rRNA序列比对和生化试验鉴定种属，并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活性和药敏特性等鉴定。【结果】从大口黑鲈肠道分离菌株84株，经测序、blast比对，筛选出3株同源性最高的菌株MS-1、MS-2、MS-3，分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。3株分离菌均为-溶血，不具有生物膜，疏水性50%93.3%，自凝集性43.6%69.2%；可在pH 2.0 12.0环境和5.0 g/L胆盐中存活；经
4、高温处理后仍可生长；3株菌对大多数抗生素敏感。【结论】芽孢杆菌MS-1、MS-2和MS-3抗逆性高，黏附性能及饲料学安全性高，可作为大口黑鲈养殖中潜在益生菌。关键词：大口黑鲈；肠道微生物；益生菌；分离与鉴定；芽孢杆菌中图分类号：S965.199；Q93-3文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0062-07doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.008Isolation and Identification of Intestinal Probiotics from Micropterus salmoidesZHAO Hao-hang1,
5、2,3,KANG Xu1,HUANG Zi-wei1,2,3,WEN Yi-ming1,2,3,WANG Zhi-wen1,2,3,YU Da-peng3GAN Zhen1,2,3,XIA Hong-li3,XIA Li-qun1,2,3,LU Yi-shan1,2,3（1.Fisheries College of Guangdong Ocean University/2.Guangdong Provincial Key Laboratory ofAquatic Animal Disease Control and Healthy culture,Zhanjiang 524088,China;
6、3.Shenzhen Institute ofGuangdong Ocean University/Guangdong Provincial Engineering Research Center for Aquatic AnimalHealth Assessment/Shenzhen Public Service Platform for Evaluation of Marine Economic Animal Seedings,Shenzhen 518120,China）Abstract:【Objective】To isolate and identify intestinal probi
7、otics of Micropterus salmoides,andevaluate the probiotics potential of the isolated bacteria as feed additives.【Method】Intestinalsamples of Micropterus salmoides were collected and bacteria were isolated by dilution coatingmethod,and species were determined by 16S rRNA sequence comparison screening
8、and biochemicaltests.Subsequently,stress resistance,adhesion,hemolytic activity and drug sensitivity characteristicswere identified.【Result】Eighty-four strains of probiotics were isolated from the intestine of第4期赵浩航等：大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定Micropterus salmoides.After sequencing and blast comparison,three st
9、rains of probiotics with thehighest homology,MS-1,MS-2 and MS-3,were screened out and identified as Bacillus licheniformis,Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus velezensis,respectively.The three isolates showed-hemolysis,without biofilm,with 50%93.3%hydrophobicity and 43.6%69.2%self-agglutination.
10、They could survive in pH 2.012.0 environment and 5.0g/L bile salt and grow after high temperaturetreatment and were sensitive to most antibiotics.【Conclusion】Bacillus MS-1,MS-2 and MS-3 havehigh stress resistance,adhesion and feed safety,and can be used as potential probiotics in theaquaculture of M
11、icropterus salmoides.Key words:Micropterus salmoides;gut microbes;probiotics;isolation and identification;Bacillus大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈，隶属鲈形目太阳鱼科黑鲈属，是食肉性温水鱼类。其生长迅速、抗病力强、适温性广、肉质鲜美，经济价值较高，养殖难度适中1。近年来，大口黑鲈养殖产量逐年升高，已成为重要的淡水名特优养殖鱼种之一2,3。由于养殖规模和密度的增加，养殖环境恶化，大口黑鲈养殖病害频发，病原复杂多样。这不仅造成巨大经济损失，也严重制约大
12、口黑鲈产业的健康可持续发展。抗生素常用于水产养殖中的疾病预防和治疗，但会导致耐药菌株的出现，并对环境产生不利影响。目前，人们开始更多地关注具有丰度高、成本低、使用方便等优点的益生菌4。益生菌在水产养殖中常用作安全添加剂，可通过促进生长、提供营养、调节微生物定植、增强免疫力、提高饲料利用率、提高消化酶活性和消化率、改善水质和抑制病原体来增强宿主的体质，可作为抗生素的替代品5。常用的益生菌有光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、蛭弧菌、硝化细菌等，其中乳酸菌和芽孢杆菌因其高拮抗活性、产胞外酶等而备受关注。芽抱杆菌对碳系、氮系、磷系、硫系等污染物以及复杂多糖、蛋白质和水溶性有机物有较强的分解能力，在养
13、殖水环境中易形成优势菌群6。张冬梅等7研究发现，在饲料中添加枯草芽孢杆菌能有效提高大口黑鲈幼鱼生长性能并改善幼鱼的肠道抗氧化能力和免疫能力。胡娟等8研究发现，饲用枯草芽孢杆菌HGcc-1显著降低鲤（Cyprinus carpio）血清中脂多糖（LPS）含量、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平，显著改善肠肝健康，并通过激活补体系统增强鲤非特异性免疫。目前已报道的水产益生菌大部分来源于宿主肠道、养殖水环境以及池塘淤泥9。其中肠道是鱼类重要的消化和吸收器官10，而大部分微生物存在于肠道壁、肠道黏膜及肠道的内容物中11。本研究从选定大口黑鲈肠道中分离微生物，并通过对分离菌株进行鉴定和体外实
14、验评估，探索分离菌的益生效果，为水产饲料中益生菌添加剂研究提供参考。1 材料和方法1.1 材料大口黑鲈幼鱼购自广东活跃水产养殖有限公司养殖场，体质量（100 10)g。用聚乙烯袋充氧运至实验室。1.2 方法1.2.1肠道细菌的分离培养将实验鱼置于添加3 4滴丁香酚的水桶中麻醉 2 3 min，用体积分数75%乙醇消毒体表，无菌条件下剖取肠道，去除消化物，用磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，pH为7.4）冲洗3次，取肠道1 g，加入1 mL PBS。在无菌条件下，使用电动匀浆器将样品均匀分散。使用稀释涂布法将肠道匀浆液分别涂布于LB、YPD、MRS琼脂平板上，其中LB平板涂布前先将肠道匀浆液在80 水
15、浴锅孵育20 min。培养24 h后随机挑取单菌落分别接种于LB、YPD、MRS培养基中扩大培养，对分离菌进行重复划线纯化，获得纯化单菌落，并进行革兰染色观察细菌形态。1.2.2分离菌株鉴定利用水煮法提取细菌DNA并扩增 16S rRNA 基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，为细菌通用引物 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。25 L 反应体系：2Mix Ex Taq 12.5 L，27F（10 mol/L）、1492R（10 mol/L）各 1 L，DNA 模 板 1 L，双 蒸 水9.5
16、L。反应条件为 96 5 min；96 30 s，55 45 s，72 90 s，共33个循环；72 10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序并拼接。在NCBI数据库中进行blast比对，选取其中同源性最高的不同种类细菌序列使用 MEGA 7 软件以 Neighbor-Joining 法构63第43卷广东海洋大学学报建系统进化树。使用蜡样芽胞杆菌生化鉴定盒（环凯微生物公司）对分离菌进行生化鉴定。1.2.3 分离菌溶血活性测定 于LB平板划线接种分离菌，次日通过挑取单菌落接种于羊血平板，对分离菌进行溶血实验，以蜡样芽孢杆菌作为阳性对照、枯草芽孢杆菌作为阴性对照。羊血平板在37 下培养24 h后观察溶血区。菌落形成狭小的草绿色环为-溶血，界限分明、完全透明的分离株记录为-溶血，在菌落周围未产生任何区域的分离株为无溶血（-溶血）。1.2.4分离菌产生物膜特性测定将分离菌划线于添加0.8 g/L刚果红的LB平板，在37 下孵育48 h。存在有干结晶稠度的黑色菌落表明生物膜产生，红色菌落表明无生物膜产生。1.2.5分离菌药敏特性测定使用杭州微生物公司
