1、东南大学学报(医学版)()():.():.:.杨晓俊侯宁史传兵.单形性亲上皮性肠道 细胞淋巴瘤的病理学特征及 表达的诊断价值.东南大学学报(医学版)():.():.():.():.().()():.()().()():.:.:.:.()():.:.():.收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目()江苏省卫生健康委员会医学科研项目()江苏高校“青蓝工程”优秀教学团队(苏教师函)江苏高校“青蓝工程”中青年学术带头人(苏教师函)作者简介 朱丽华()女江苏南通人副教授理学博士:.通信作者 蒋犁:.引文格式 朱丽华王新宇韩奕文等./在少突胶质细胞前体细胞中的作用研究.东南大学学报(医学版
2、)():.论著/在少突胶质细胞前体细胞中的作用研究朱丽华王新宇韩奕文莫思思疏佳萍蒋犁(.江苏卫生健康职业学院江苏 南京 .扬州大学 附属医院江苏 扬州 .东南大学 附属中大医院江苏 南京 .东南大学 医学院江苏 南京)摘要 目的:探讨/脑源性神经营养因子()在少突胶质细胞前体细胞()中的表达变化和相互作用 方法:运用生物信息学分析方法分析脑室周围白质损伤幼鼠脑组织中具有差异表达的 和其相互作用的 和 分离培养出 将其分为对照组(组)和氧糖剥夺()、组即、组采用 法检测、基因表达水平使用蛋白质印迹法检测 蛋白表达水平 结果:生物信息学分析提示、存在相互作用、组 内 的表达较 组均降低差异均有统计
3、学意义(.)而 的表达较 组均升高差异均有统计学意义(.)、两组与 组比较差异均有统计学意义()结论:/三者在 的 中表达具有相互关系 表达的降低对 的作用减弱促进了其靶向 的表达关键词 少突胶质前体细胞 环状 脑源性神经营养因子 氧糖剥夺 大鼠中图分类号 文献标志码 文章编号():././(.):/()().:.()().:.().(.)(.).:/.脑室周围白质损伤()是早产儿脑损伤的一种主要形式其重要的病理变化之一是少突胶质细胞()的损伤 在发育过程中被分为 个阶段即早期少突胶质细胞前体细胞()、晚期、未成熟 和成熟而早产儿缺氧缺血性 多发生在胚胎 周此时脑组织内 主要以 和未成熟 为主
4、 比成熟 更容易出现缺氧缺血性损伤引起的功能障碍 一旦发生脑损伤 则发生凋亡或坏死其成熟过程被中断成熟 大量降低髓鞘形成减少脑源性神经生长因子()是在脑内合成的一种蛋白质它作为神经营养因子家族的成员广泛分布于中枢神经系统不仅对多种神经元的成活、生长和分化有重要作用同时东南大学学报(医学版)年 月()在神经元以外的细胞发育过程中也发挥重要作用 的表达水平与新生儿脑损伤的发生具有相关性有研究发现 可以抑制脊髓损伤后巨噬细胞的浸润并干扰脱髓鞘和再髓鞘化提示 可能在损伤后修复过程中影响的细胞不仅是神经元还有胶质细胞 进而在对 的研究中发现 不仅促进神经分化和存活而且在 的增殖、迁移和髓鞘化中也发挥重要
5、作用 但是 在 中的调节作用仍然不明确环状()广泛参与神经系统的生理、病理过程在神经系统中 可以直接影响其发育调节神经细胞的增殖、分化和凋亡过程另外 对疾病的发生发展、损伤后修复都有重要的调节作用 在神经系统中微小()轴调节基因表达对于维持正常脑功能至关重要 对炎症诱导早产小鼠脑组织 表达谱分析发现其发生明显变化而且 的表达变化可通过调控 的活性在早产小鼠脑损伤及之后的脑发育中发挥作用 近年来我们收集了 大鼠脑组织采用高通量测序技术发现脑组织中 的表达与正常脑组织比较具有显著改变在这些 中有没有作用于 与 表达相关的呢?本研究旨在体外采用氧糖剥夺()的 模型分析 与 之间的关系以期为进一步研究
6、 在 中调控 的机制打下实验基础 材料与方法.的分离与培养选取肤色红润营养状态良好的()新生大鼠()体质量 雌雄不拘购自南京医科大学实验动物中心许可证号:(苏)采用七氟烷麻醉 于乙醇中浸泡 分离出大脑皮质放入装有 的无菌培养皿中枪头吹打成单细胞悬液经消化、离心、过滤、孵育待细胞生长至 进一步纯化分离 培养瓶用封口膜封闭后置于 恒温振荡仪上振荡 无菌 清洗 遍更换混合培养基静置培养 再次置于恒温振荡仪振荡 收集含细胞团的培养液离心 转移上清至原混合胶质细胞培养瓶加 限定培养基重悬细胞沉淀.的 模型的建立提前 将无糖培养基置于低氧环境()、的培养箱中以除去培养基中所含氧气 将纯化后培养第 天的 更
7、换为无糖培养基于低氧细胞培养箱中分别培养干预结束后取出培养板更换为限定培养基重新放回细胞培养箱中复氧 .细胞分组和处理纯化后的 接种于包被过的 孔板中种植密度为 分化培养 后的 分为 组即对照组(组)和 个 组 组继续正常培养 模型组更换为无糖培养基于低氧细胞培养箱中分别培养、后(即、组)重新放回 体积分数细胞培养箱中复氧.生物信息学分析利用 和 数据库预测与 相互作用的多个 选取两个数据库共同出现的 为 相互作用的 再利用 数据库预测 靶向的上游 找出相互作用和靶向的 进一步检测其在 中的表达.实时荧光定量()检索基因文库中的、及 的基因序列应用软件 .设计引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合
8、成:上游引物 下游引物 :上游引物 下游引物:上游引物 下游引物 收集各组 细胞用 试剂(美国 公司)进行裂解后严格按照说明书操作并提取用核酸分析仪检测提取 的纯度和浓度/的值在.的范围内代表 的质量可以用于 实验 使用 逆转录试剂盒(美国 公司)对提取的细胞总 进行逆转录 荧光定量 仪(美国 公司)合成 扩增条件为 个循环达到平台期 每份标本均设 复孔检测使用 值进行统计学分析.蛋白质印迹实验收集各组 细胞与加样缓冲液 体积混合煮沸 凝胶电泳分离蛋白再转至 膜后放入脱脂奶粉封闭 加入一抗(.)孵育过夜加入二抗()化学发光朱丽华等./在少突胶质细胞前体细胞中的作用研究法显影及定影以 作为内参
9、结果用 软件进行灰度分析.统计学处理应用 .软件进行统计学分析多组比较采用单因素方差分析()检验分析两组间差异数据以 形式表示 .表示差异具有统计学意义 结 果.与 及 预测通过检索 数据库发现在大鼠组织中 靶向的上游 共有 个分别为、在前期的研究过程中我们已采用高通量测序技术检测发现幼鼠脑损伤后脑组织中 的表达具有显著改变选取显著差异表达并被验证的 个 利用 和 数据库预测与之相互作用的 发现 靶向的上游 与:相互作用的 中的交集为:在缺氧缺血性 模型鼠脑组织中呈低表达 其宿主基因为所以将之表达为 从而预测出相互作用和靶向的/进一步检测其在体外分离纯化的 中的表达变化.检测 与 的变化我们采
10、用 的 作为体外模型运用 定量分析、在 细胞中的表达 结果显示、组 内 的表达较 组均降低差异均有统计学意义(.)随着 时间的增加 的表达进一步降低 与之相反 在、组表达则均较 组增多差异均有统计学意义(.)、两组与 组比较差异均有统计学意义(.)见图 图 内 和 的定量检测结果 图 内 蛋白质印迹法检测结果 东南大学学报(医学版)年 月()讨 论本研究采用生物信息学分析法预测 鼠脑组织中差异表达的 与 及 间的靶向关系进一步采用 的 模型模拟早产儿 发现在 的 中随着 表达的下降 表达是上升的而 表达是降低的在早产儿 病变早期即有、星形胶质细胞、小胶质细胞 种胶质细胞发生改变其中以形成轴突髓
11、鞘的 易感性较强遭受缺血缺氧、谷氨酸和自由基毒性等损伤时迅速凋亡 而 在脑白质中分化成髓鞘使神经信号的快速传导和代谢支持成为可能 故而本研究提取幼鼠脑组织中 进一步运用 的 模型体外模拟早产儿缺氧缺血性并探究 及其靶向的 和 的表达变化 目前对 的急性缺氧模型的最佳干预时间为.本研究组前期对 的 活性检测的研究中也发现在、细胞活性逐渐降低而干预 后细胞活力降低约故本研究采用此 个关键时间点展开研究早产儿 发生后 成熟过程中髓鞘化至关重要与脑损伤的程度呈相关性 已有观点认为 在脑白质中分化成髓鞘是通过诸如 等营养因子对细胞细胞相互作用来维持 在脱髓鞘疾病的研究中发现脱髓鞘损伤后多种内源性因素对
12、的生长和维持起调节作用其中 发挥了重要作用 同时对未成熟脑损伤幼鼠脑组织的研究发现一些药物可上调受损脑组织中 表达随之 和髓鞘蛋白表达亦随之上调 作为神经营养因子家族的一员其神经营养作用不仅仅体现在促进神经元细胞的存活还能显著促进轴突再生另外可以通过激活 表达的原肌球蛋白相关激酶 受体促进中枢神经系统在发育和损伤后的髓鞘化 既往研究发现 在 中表达增多可促进 增殖增强髓鞘形成对神经损伤和白质损伤均具有保护作用 另外一项试验研究 前体()在 增殖和迁移中的作用发现 可以抑制永久性()的增殖和迁移而抗 治疗可有效保护细胞凋亡促进细胞增殖和迁移 所以现在认为 可能是中枢神经系统损伤的治疗靶点 故本研
13、究将研究对象确定为 并检测其体外表达变化 研究结果显示 的 在缺氧后 的表达是下调的说明缺氧降低了 内 的表达而 的低表达可能会抑制 的成熟和髓鞘化 那么又有哪些物质与 相关可以调控 的表达呢?近年来随着对早产儿 发生机制的不断研究、长 链 非 编 码、等被证明参与早产儿 的发生及发展但仍未明确阐明其调节机制 在对人甲状腺乳头状癌组织的研究中发现 通过抑制靶基因 的表达扮演抑癌基因的角色 癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为可能与 调控 通路有关 本研究结果显示 在 的 中表达是降低的而预测与 相互作用的 在 的 内表达是上调的而且随着 时间的延长其表达持续上升提示 在 的表达中可能有一定作用 有报道指出
14、 可靶向 包括 海绵、转录调节、干扰剪接和翻译产生多肽等进一步作用于 通过 轴调节基因表达 许多 含有 反应元件与 结合后可形成 复合物抑制 的功能阻止其作用于靶向 从而抑制 降解促进蛋白质翻译改善靶基因的表达 比如 含有丰富的 结合位点作为 结合的“分子海绵”能够吸引、结合并抑制 功能 是本研究组前期实验研究证实的缺氧缺血性 鼠脑组织中较正常脑组织表达明显降低的 本研究通过生物信息分析法发现 与 具有靶向作用进步检测两者的表达显示两者的表达趋势是相反的 在 的 内表达上调但 的表达则是下降的 所以本研究推测在脑损伤后 内 表达降低可能对 的海绵作用减弱所以 被释放 促进了其靶向 的表达综上本
15、研究结果提示/三者在 的 中表达具有相互关系 表达的降低对 的作用减弱促进了其靶向 的表达 但是三者在 中及早产儿脑损伤中的病理机制尚未明确还需进一步研究参考文献 .()()朱丽华等./在少突胶质细胞前体细胞中的作用研究.:.:.:.():.():.():.:.():.莫思思朱丽华李棒棒等.大鼠少突胶质前体细胞的纯化及氧糖剥夺对其活性的影响.东南大学学报(医学版)():.:.:.:./.():.():.():.:.():.高笑妮杨丽君张囡等.新生未成熟大鼠缺氧缺血性脑损伤时微小 对缺氧诱导因子 的调控作用.中华新生儿科杂志(中英文)():.:./.:.():.魏思萌肖谧郑曦等.环状 在炎症所致早产小鼠脑损伤中的作用及机制初步研究.中国当代儿科杂志():.():.胡志刚赵鹏新马维远等.微小 调控脑源性神经营养因子在甲状腺乳头状癌中的作用机制研究.中国耳鼻咽喉头颈外科():.宋晋梁婷王强等./通路在低频重复经颅磁刺激影响癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为中的作用.中国老年学杂志():.():.():.():.东南大学学报(医学版)年 月()
