1、2023年7 月第43卷第7 期Jul.2023 Vol.43 No.7综述本文引用：廖端芳，张佳，卢光明，李凯.DNA甲基化谱：流的生命脉律：纪念DNA双螺旋结构发现7 0 周年 .湖南中医药大学学报，2023,43(7):1315-1319.湖南中医药大学学报Journal of Hunan University of Chinese MedicineDNA甲基化谱：流消的生命脉律纪念DNA双螺旋结构发现7 0 周年1315廖端芳1.2,张佳1,卢光明3,李凯1.2*1.湖南中医药大学个体化诊疗技术国家（联合）工程研究中心，湖南长沙410 2 0 8；2.湖南中医药大学湘产大宗药材品质评价
2、湖南省重点实验室，湖南长沙410 2 0 8；3.中国人民解放军东部战区总医院，南京大学医学院附属金陵医院，江苏南京2 10 0 16【摘要】7 0 年前，随着DNA双螺旋结构的发现，人类进入基因组时代；2 1世纪初，人类基因组测序完成及对转录组、蛋白质组和表观遗传的研究，人类继而进入后基因组时代；近年对DNA甲基化的深入研究，预示更为神秘宽广的表观遗传组学时代已经到来。人体血液中大量存在的甲基化DNA构成甲基化谱，作为一个整合性指标，有如一曲流消的生命脉律,反映不同细胞的生理或病理状态。精准分析甲基化谱，具有诊断疾病特别是肿瘤早筛早诊的价值；同时可作为人类健康、乃至天赋的量化评估指标；也可用
3、于中医体质辨识与证型分类及中药材溯源、真伪识别和品种改良。本文介绍表观遗传组学时代甲基化谱的重要意义，以纪念DNA双螺旋结构发现7 0 周年。【关键词】DNA甲基化；甲基化谱；游离核酸；表观遗传；肿瘤早筛【中图分类号 R2【文献标志码 A【文章编号 doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2023.07.026DNA methylation profile,the flowing melody of life:Marking the 70th anniversary of discovering DNA double helixLIAO Duanfang,ZHANG Jid,
4、LU Guangming,LI Kail2*1.National Engineering Research Center of Personalized Diagnostic and Therapeutic Technology,Hunan University ofChinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of HunanProvince,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Huna
5、n 410208,China;3.General Hospital of EasternTheater Command,Jinling Hospital of Nanjing University,Nanjing,Jiangsu 210016,ChinaAbstract Seven decades ago,the discovery of double helix structure announced the genetic era of human beings;at thebeginning of the century,human genomic sequencing,study of
6、 transcriptome,proteome,and epigenetics marked the post-genomicera;in recent years,the study of DNA methylation signifies the era of mysterious epigenetics.DNA methylation profile is composedof numerous DNA methylation markers in human blood.As the integrated parameter,it resembles the flowing melod
7、y of life,andreflects the physiological or pathological statues of the cells.The methylation profile can diagnose diseases such as cancer at itsearly stage,evaluate healthy status and constitution,classify the patterns of Chinese medicine,and standardize the diagnosis ofChinese medicine.In addition,
8、it can help trace,identify and improve the Chinese medicines.To mark the 7Oth anniversary ofdiscovering double helix structure,this paper introduces the biomedical significance of methylation profile.Keywords DNA methylation;methylation profile;circulating cell-free DNA;epigenetic;early detection of
9、 cancer【收稿日期 2 0 2 3-0 1-19【基金项目】湖南省教育厅重大病毒感染性疾病防治科技攻关项目（湘财教指 2 0 2 0 17 号文件);湖南省科技创新团队(2 0 2 1RC4064)。【第一作者 廖端芳,男，博士,教授，研究方向：细胞脂代谢与基因调控。【通信作者*李凯，男，博士，教授，E-mail:。1316生命，是一首歌，通过优美的DNA双螺旋结构奏响着由A、T、C、G 和甲基化C5种音符组成的动人旋律 1-2 ;生命,是一条河,流尚着蕴含亿万细胞交织而成的甲基化谱脉律。每个个体的生命,从诞生到离去,那动人的5种音符，从深奥无底的基因组，透过甲基化胞嘧啶(methylc
10、ytosine,mC)组成的甲基化谱，无时无刻不在我们血液中流消，是我们生命的脉律，影响着我们的人生。在跨入2 1世纪之际，随着人类基因组测序计划完成,人类获取了由ATCG和甲基化C 5种核酸构成的长达30 亿个碱基音符的生命天书，定义了我们所处的时代为后基因组时代 3-。解码生命天书，成为当代生物科学技术的主旋律。甲基化谱,是生物体DNA不同CpG位点甲基化数量在某一时刻的总和16-8 。基因组中的每个单一CpG位点,通过不断更新或调亡细胞释放人血的游离核酸，携带其组织的特异性信息，这些信息的集合反映机体不同系统、器官、组织的生理或病理状态。同一个体在不同时间、不同个体在同一时间，甲基化状态
11、均有不同；血液游离核酸所呈现的甲基化谱亦相应有所区别 9-10。因此,游离核酸甲基化谱是生命的信息子集，是一个高度动态、由不同细胞类型凋亡或死亡细胞碎片化核酸组成的瞬时集合，与之相对应的细胞甲基化图谱，则属于特定细胞类型各自具有的、相对恒定的甲基化组学序列10-12 。核酸甲基化是表观遗传的主要方式 12-15,通过对编码人类大约5万种蛋白质的基因在何时何处以及何种强度进行甲基化调控，使生命乐章得以完美演奏。甲基化调控基因的表达水平,抑癌基因的甲基化可显著增加癌症发生的风险 16-18 。文献报道,超过2500多种基因参与肿瘤的发生和发展过程,早期肿瘤为单克隆，而晚期肿瘤常常表现出高度异质性，
12、即多克隆或实际为多种疾病的集合 19-2 0 。DNA甲基化也与循环肿瘤细胞的干细胞特性、解聚及转移能力相关 2 1。以上提示,DNA甲基化对指导肿瘤早期诊断、早期治疗及转移监控具有非常重要的价值。参与特定肿瘤发生的基因种类多样，早期诊断需要对尽可能多的基因甲基化进行高敏感检测 在现有甲基化分析技术中,聚合酶链式反应(poly-merase chain reaction，PC R)检测一个或少数几个甲基化位点，而二代测序(next gene sequencing，NG S)可进行组学层面的甲基化测序 2-2 3。甲基化分析技湖南中医药大学学报http:/空白对照.ACGmCGT.扩增与分析.A
13、CGCGT.ATGCGT.图1亚硫酸氢钠化学转化原理为克服亚硫酸氢钠相关技术的致命缺陷，多种新技术已用于DNA甲基化研究 2 6-2 8 。其中,以甲基化依赖酶为核心的单序列特异性引物甲基化检测技术和med-NGS技术，人工创造了一系列抑制接头自连系统，结合广泛用于基因编辑的金门克隆技术，构建动态抑制甲基化接头的自连，并促使可逆反应向接头与待测核酸形成产物的方向进行 2 8-31(图2)。这些创新性技术，可对数个到成千上万个CpG选定位点设计序列特异性引物（图3），以达到在不破坏待测核酸前提下对甲基化核酸的富集和解码,均可望成为甲基化谱的标配技术。GGCGCCGCGCGCCGCGACGTTGC
14、A图2 甲基化谱技术中甲基化敏感酶抑制接头自连的机制注：采用CGAT接头，接头自连后形成甲基化敏感性内切酶ClaI的酶切位点，而目标片段与接头连接后的产物不能恢复相应酶切位点，化学反应在抑制接头自连的同时，使反应主要向待测片段连接接头方向进行。2023年第43卷术虽已用于肺癌、结直肠癌等筛查，但这些技术大都采用亚硫酸氢钠对未甲基化的胞嘧啶(C)向尿啶(U)进行转化,U在PCR或测序时的后续扩增中表现为T,而甲基化的C则维持不变,比较化学转化前后两个标本，即可得到待测标本的CpG是否甲基化。因此,保留了mC在基因分析时仍呈现为C的基本结构特征（图1)。由于亚硫酸氢钠在上述化学转化过程中大量破坏核
15、酸,相应技术对低拷贝DNA甲基化表观遗传学信息进行检测的敏感性不高，用于肿瘤的早期诊断存在很大局限性 2 4-2 。待测核酸样本.A.CGmCGT.亚硫酸氢钠处理.AUGCGT.GGCCGAT-7GTA甲基化敏感性CGC内切酶TGCCGAT-P7TAT4连接反应CCGATP7GGCTACGAT-P7TAGCGATP7CGCTA甲基化敏感性内切酶P7-TAGCTAACGATP7TGCTAATCGATP72023年第43卷5.CmC(N)123.GG(N)16Methylation-dependent restriction digestionPNGS15.NNNN5.NNNN-3or3Ligat
16、edwithoneof thetwoadaptersPCRNGS图3单一序列特异性引物甲基化技术工作原理图注：甲基化依赖性内切酶识别甲基化位点，并在其下游形成1个四碱基突出的粘性末端，通过连接酶与含有4个简并碱基NNNN的发夹接头或双链接头在连接酶作用下连接，之后即可通过序列特异性单一引物进行PCR的指数扩增。该技术可以用于PCR、微阵列、NCS等多种技术平台。从基因组时代到后基因组时代，从遗传学时代到表观遗传学时代，从单个甲基化位点检测到甲基化组学测序，生物科技和生命科学领域经历了漫长而艰辛的探索。在2 1世纪2 0 年代之初，当全球生物医学因为新冠疫情不得不重复开发和广泛应用相对原始的核酸检测RT-PCR技术的特殊时期,甲基化谱技术的出现，拓展了其在重大传染病防治中的应用 32-3。再次使我们可以通过表观遗传学,去聆听生命的歌，去感受生命的脉律，去呵护生命的美好。甲基化谱是机体细胞新陈代谢在基因层面的一个瞬时性总体集合，重复检测甲基化谱，可以动态反映组成生命各系统、各器官的细胞更新速率和各种细胞基因表达调控水平的变化程度。人类基因组含有大约2 8 0 0 万个CpG位点，这些位点的
