1、华北农学报():收稿日期:基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)()河南省现代农业产业技术体系建设专项资金()作者简介:韩浩园()女黑龙江阿城人讲师博士主要从事动物遗传资源研究通信作者:权 凯()男甘肃陇西人教授博士主要从事羊生产与推广研究 和 基因多态性及其与槐山羊产羔数的关联分析韩浩园李 涛李世凯宋小雨李 君哈 斯赵金艳魏红芳权 凯(.河南牧业经济学院 动物科技学院河南 郑州.华南农业大学 动物科学学院广东 广州.宁夏大学 农学院宁夏 银川)摘要:为探究 和 基因对槐山羊繁殖性能的影响以 只不同产羔数的槐山羊群体为研究对象参照 数据库中山羊 和 基因参考序列设计引物利用 与测序技术
2、扫描 和 基因单核苷酸多态性()并进行遗传多态性、群体遗传参数分析和基因型与产羔数的关联分析 结果表明在 基因中检测到 个 位点:.和.均为同义突变在 基因中检测到 个 位点:.、.和.均位于非编码区 基因.位点和 基因.位点为低度多态 基因.位点、基因.和.位点为中度多态 卡方检验结果表明 个 位点均处于 平衡 基因型与产羔数的关联分析结果表明 基因 个 的各个基因型间槐山羊产羔数的差异不显著不适用于槐山羊群体的多羔性状选育 基因.位点的 基因型个体产羔数显著高于 基因型.位点 基因型个体产羔数显著高于、基因型(和.位点呈现强连锁平衡状态(.)单倍型关联分析结果显示 基因 单倍型个体的产羔数
3、显著高于、单倍型个体的产羔数(位点 基因型与.位点 基因型以及 单倍型个体具有较高的产羔数可作为槐山羊产羔数选育的潜在分子标记关键词:槐山羊 基因 基因产羔数中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.):.().(.).(.).华 北 农 学 报 卷 .(.(.).(.:产羔数是山羊生产中重要的经济指标山羊的产羔数由多个基因共同控制遗传力低常规的育种技术难以对其改良 利用标记辅助选择()技术对山羊的产羔数量性状进行筛选已成为当前的研究热点间隙连接蛋白()也称为缝隙连接通道可形成细胞间膜通道细胞间以此连接通道为直接途径传递代谢物质和信号分子 卵巢、卵泡、卵母细胞以及胚胎发育等生理过程均受
4、间隙连接蛋白调控 研究发现特异性敲除小鼠颗粒细胞的 后造成卵泡形态异常卵母细胞的胞质和颗粒细胞空泡化 在卵泡发育的早期阶段含有 组成的连接通道是维持颗粒细胞群扩张所必需的若缺乏连接通道会对卵母细胞的生长与成熟造成损害 家族成员众多编码间隙连接蛋白()的 基因属于 家族成员目前 基因研究主要集中在耳聋以及其他疾病上 关于 基因与繁殖性能关系的研究极少仅在云上黑山羊产羔性能研究中发现 基因突变位点 .和.的不同基因型与产羔数间相互关联且差异性显著可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记 此外有研究发现 蛋白在卵丘细胞的细胞质中表达 综上所述 家族 基因在动物繁殖性能方面研究较少但可能影响山羊的产羔
5、性状腺苷活化蛋白激酶 亚基()蛋白属于哺乳动物的单磷酸腺苷活化蛋白激酶()家族中一员是在血管细胞和单核/巨噬细胞中发现的主要亚型在哺乳动物中参与细胞生 长、细 胞 周 期 调 节 和 能 量 代 谢 等 多 种 过程 是构成 的催化亚基之一研究发现 具有维持猪和牛卵母细胞减数分裂的作用其他 基因多态性研究多集中于胃癌、慢性乙型肝炎等疾病中 有关 基因与山羊繁殖性能关系的研究极少仅 等在济宁青山羊群体中检测到 基因为潜在的产羔数性状关联的候选基因 然而山羊 基因的遗传多态性及其与产羔数的关系尚未见报道槐山羊是国内为数不多的高繁力山羊品种为了筛选 和 基因的单核苷酸多态性()突变并探究 和 基因
6、与山羊产羔性状之间的关系本研究检测了不同产羔数槐山羊群体中 和 基因多态位点对筛选出的 与槐山羊的产羔数进行了相关性分析以期能够找出与槐山羊产羔数相关的潜在分子标记为 和 基因功能的进一步研究奠定基础 材料和方法.样本采集利用负压抗凝采血管采集 只母羊颈静脉血液样本依据沈丘县农牧科技研发中心的繁殖记录表记录母羊的产羔季节、胎次、产羔数等信息依据产羔数将群体分为单羔组(只)、双羔组(只)和多羔组(只)血液样本置于干冰暂时保存带回 期韩浩园等:和 基因多态性及其与槐山羊产羔数的关联分析 实验室后置于 冰箱中保存备用.提取利用血液基因组柱式小量提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取 只槐山羊颈
7、静脉血样的全基因组 采用紫外可见分光光度计法对 的浓度和质量进行测定 将基因组 稀释至 /放置 进行保存用于后续试验.引物设计基于 数据库中已经公开的山羊 基因(登录号:.)和 基因(登录号:.)的参考序列使用 .设计特异性扩增引物(表)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成表 和 基因的引物序列.基因名称 引物序列()()产物长度/退火温度/:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.扩增 扩 增 反 应 体 系 为 包 括.、(康 为 世 纪).、上下游引物各.(/)、模板 (/)扩增条件:预变性 变性 退火 (退火温度见表)延伸 共 个循环最后 延伸 保存 产物经 的琼脂糖凝胶电泳检
8、测后扩增条带单一且明亮的引物用于后续试验.扫描及基因分型依据产羔数将 个槐山羊 样品混合为 个 池进行 及琼脂糖凝胶电泳检测后经生工生物工程(上海)有限公司测序使用 软件对测序峰图进行分析筛选混合样的突变位点 采用产生突变位点的引物对 只槐山羊样品进行测序及基因分型.数据分析利用 软件对 的基因型频率、等位基因频率、基因杂合度()、多态信息含量()和有效等位基因数()等进行计算并进行哈代温伯格平衡()检验 利用 数据库(:/./)对 进行连锁不平衡()与单倍型分析 采用 .中的一般线性模型()进行槐山羊 基因和 基因 与产羔数的关联分析并进行不同单倍型与产羔数的关联分析 结果与分析.扩增结果对
9、 和 基因序列进行 扩增后琼脂糖凝胶电泳结果表明 基因第 对引物及 华 北 农 学 报 卷 基因第 对引物扩增产物条带清晰、单一、整齐没有残留目的条带与预期扩增片段大小一致可用于后续研究 部分扩增结果如图 所示.混合样.图 和 基因部分扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测.槐山羊 和 基因 扫描结果测序发现 和 基因共存在 个 其 中 以 已 知 山 羊 的 基 因(.)序列为参照槐山羊的 基因存在 个 位点分别位于第 (/)和(/)处(图)均为同义突变 突变前后均编码丝氨酸 突变前后均编码缬氨酸与参考序列.比对后将 基因的 突变命名为.将 突变命名为.图 基因 个 位点测序峰图.以已知山羊的 基因(
10、.)序列为参照槐山羊 基因存在 个 位点分别位于第 (/)、第 (/)和第 (/)处(图)个突变均位于基因的非编码区不编码氨基酸 与参考序列.比对后分别将 基因 突变、突变和 突变命名为.、.和.槐山羊 和 基因分型利用 软件以及 软件将分型结果进行整理结果显示 和 基因的 个 均存在 种基因型各基因型的个体数分布见表 分别对 个 进行基因型频率和等位基因频率分析(表)基因.位点的等位基因频率存在明显的差异 为优势等位基因等位基因频率为.位点 为优势基因型 为优势等位基因等位基图 基因 个 位点测序峰图.期韩浩园等:和 基因多态性及其与槐山羊产羔数的关联分析 因频率为.基因的.位点 为优势基因
11、型 为优势等位基因等位基因频率为.位点 为优势基因型 为优势等位基因等位基因频率为.位点 为优势基因型 为优势等位基因等位基因频率为.表 和 基因 分型结果.基因多态位点基因型个体数/只.槐山羊 和 基因 遗传多样性分析对 和 基因的 位点进行了卡方检验()及多态信息含量、杂合度、有效等位基因数等遗传参数分析(表)结果表明 基因.位点和 基因.位点多态信息含量低于.属于低度多态与杂合度结果相符 基因.位点、基因.和.位点属于中度多态位点 平衡分析显示 个 位点 检验结果均小于.处于 平衡.槐山羊 和 基因 的连锁不平衡分析槐山羊群体 和 基因 个 的连锁不平衡分析结果显示 基因.和.位点间 .
12、、.(.和.位点间.、.(.)属于强连锁平衡状态而.和.以及.和.之间 .(.)(.)(.)(.)(.).(.)(.)(.)(.)(.).(.)(.)(.)(.)(.).(.)(.)(.)(.)(.).(.)(.)(.)(.)(.)表 槐山羊 和 基因 位点的遗传多样性.多态位点卡方检验多态信息含量杂合度有效等位基因数.注:.().槐山羊 和 基因型与产羔数的关联分析应用 .软件的一般线性模型对 和 基因中存在的 位点进行基因型与产羔数的关联性分析结果见表 基因 不同基因型间的产羔数差异不显著 而 基因.位点的 基因型个体产羔数与 基因型个体产羔数差异显著 基因型产羔数比 基因型多.只.位点
13、基因型个体产羔数与、基因型个体产羔数差异显著 基因型产羔数比 基因型多.只 结果表明.位点 基因型和.位点 基因型的产羔数较高.和 基因 单倍型与产羔数的关联分析单倍型分析发现 基因的 个 将群体分为 种单倍型:、和 利用 .华 北 农 学 报 卷表 和 基因突变位点的多态性与槐山羊产羔数的关联分析./基因多态位点基因型样本数/只产羔数/只.注:不同小写字母表示差异显著(.)表 同:(和.均与陶林等在 基因中发现的突变位点一致 有研究表明基因在哺乳动物中相当保守平均同义替换率远远高于非同义替换率与本研究结果相符表 和 基因单倍型对槐山羊产羔数的影响.基因单倍型单羔 双羔 多羔 个体数/只频率个
14、体数/只频率个体数/只频率产羔数/只.指标用于衡量基因的变异程度当 水平高等位基因数量多杂合度高时说明该群体的多态位点具有较高的遗传变异具有很好的选择性本研究 测定结果表明槐山羊中 基因.位点为中度多态(.位点为低度多态(和.位点均处于 平衡状态 与云上黑山羊和济宁青山羊一致表明这 个 在长期的进化和自然选择中具有一定的遗传优势从而达到了平衡本研究进行了 基因 位点与产羔数的关联性分析结果表明.位点和.位点的不同基因型、单倍型与槐山羊的产羔表型数据均无显著相关性(.)说明上述位点均不是影响槐山羊产羔数的关键位点 而在云上黑山羊的研究中发现 基因.型的产羔数显著高于 型.型的产羔数显著高于 型
15、基因的组合基因型分析发现 型的产羔数显著高于 型说明 的 个位点可作 期韩浩园等:和 基因多态性及其与槐山羊产羔数的关联分析 为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记 以上结果表明.和.位点可作为云上黑山羊产羔数的分子标记却与槐山羊的产羔数无关说明山羊品种间影响产羔数的基因可能不同.基因多态性与山羊产羔数的关系本研究进行了槐山羊 基因的 分析发现 个 位点.、.和.个 位点均位于非编码区有研究表明编码区域的突变往往影响个体的正常生长和发育因此在非编码区域中检测到的 多于编码区域 测定结果表明 基因.和.位点在槐山羊群体中处于中度多态 数值大小可以反映出种群中个体的均一性数值越大遗传变异越大反之则群
16、体变异越小 本研究结果表明槐山羊.和.位点杂合度较高说明这 个位点具有较高的遗传变异有很好的选择性且处于强连锁平衡状态可以通过这些位点进行标记来辅助育种目前尚无对山羊 基因 与产羔数相关性的研究本研究中槐山羊 基因型与产羔表型的关联分析结果显示.位点的 基因型产羔数极显著高于 基因型.位点 基因型的产羔数显著高于、基因型 且单倍型分析结果说明 单倍型个体产羔数显著高于、单倍型说明 基因单倍型 槐山羊产羔数更多在对济宁青山羊产羔数性状的关联分析中通过对不同产羔数分组的选择消除分析鉴定出 基因是与山羊产羔数相关的潜在候选基因 此外有研究发现 具有维持猪和牛卵母细胞减数分裂的作用 通过调控 促进卵母细胞成熟调控类固醇生成和抑制卵泡细胞凋亡 本研究结果支持了以上研究结论 且本研究首次发现.和.位点与山羊产羔数相关可作为多羔性状选育的潜在分子标记 但本研究的样本数量有限且突变位点仅限于非编码区还需扩大样本数量进一步研究综上在槐山羊 基因中发现 个 分别为.和.为同义突变与槐山羊产羔数之间无显著相关性 在槐山羊 基因上共发现了 个 分 别 为.、.和.位于非编码区.位点的 基因型产羔数显著高于 基
