1、基础研究 细胞对异基因造血干细胞移植术后患者 淋巴细胞增殖及干扰素 分泌的影响陈璐，倪明，王力，潘成云，亢倩，詹云，赵鹏，王季石，（贵州医科大学附属医院 血液内科，贵州 贵阳 ；贵州医科大学 临床医学院，贵州 贵阳 ；苏州大学附属第一医院国家血液病临床研究中心，江苏 苏州 ）摘要目的探讨多形核的髓系来源抑制性细胞（）对异基因造血干细胞移植（）术后患者 淋巴细胞增殖和干扰素 （）分泌的影响。方法抽取 例 术后患者第 天及 例健康供者任意时间点空腹全血标本，先采用中性粒细胞分离液分离 组受检者外周血含 与 细胞的白细胞、再采用流式分选出患者 与 细胞及健康供者 ；采用瑞氏 姬姆萨（）染色观察 组受
2、检者外周血 的形态学特征，法检测、及 时 术后患者外周血 细胞凋亡情况，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（）染色和荧光酶联免疫斑点（）法检测 术后患者外周血 对 细胞增殖及 表达的影响。结果 术后患者 多呈不成熟粒细胞表型，健康供者 呈成熟粒细胞表型，且患者 于 时大部分仍处于存活状态；和 实验表明 术后患者 可抑制其 淋巴细胞的增殖、分裂及胞内 的释放。结论 可抑制 术后患者 淋巴细胞的增殖及分泌 。关键词淋巴细胞；细胞增殖；干扰素 ；多形核的髓系来源抑制性细胞；免疫抑制 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，；，）（）（）（）；第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目
3、 国家自然科学基金（）；国家血液系统疾病临床医学研究中心转化研究课题（）；贵州省科学技术基金（）；贵州医科大学附属医院 面上基金培育计划项目（）贵州医科大学 级硕士研究生通信作者 ：引用本文：陈璐，倪明，王力，等 细胞对异基因造血干细胞移植术后患者 淋巴细胞增殖及干扰素 分泌的影响 贵州医科大学学报，（）：，；，；（）（），；异基因造血干细胞移植（，）术后可发生多种并发症，其中较典型且严重的为移植物抗宿主病（，），及 度急性 （，）患者的年生存率分别为 和 。随着免疫学研究的不断进展，有学者认为免疫调节疗法取代目前的免疫抑制疗法是未来 治疗所追求的目标 。髓系来源的抑制性细胞（，）是一群具有免
4、疫抑制性的髓细胞，最主要的功能是抑制由固有免疫和获得性免疫介导的反应 。大量研究表明，已成为癌症、感染、慢性炎症及自身免疫性疾病中的主要免疫抑制细胞，提示 可能有助于控制 。目前，针对各亚型 通过不同机制预防及控制 的研究基本仅限于动物模型 ，体外实验也仅限于现象学观察，缺乏相关机制学研究 ，。因此，本研究主要通过流式分选出 术后患者新鲜外周血中多形核的 （，）及 淋巴细胞，采用共培养方式探究人 对 淋巴细胞增殖、经典淋巴因子干扰素（，）分泌的免疫抑制作用，为临床 作为 防治策略提供理论和实验依据。材料与方法 实验材料 样本来源及分组选取 年 月 年 月 术后患者 例及健康供者例，要求符合术前
5、接受清髓治疗、术后临床确诊巨细胞病毒（，）感染，排除行自体造血干细胞移植（，）术患者、临床资料不完善者及患传染性疾病（如乙肝、梅毒、艾滋病等）患者。取患者移植完成后第 天时及健康供者任意时间点新鲜外周血（未过夜）作为标本来源。本研究已根据 赫尔辛基宣言 获得了病人以及供者知情同意。主要试剂及仪器抗分化簇 抗体 （，）、抗人类白细胞抗原 抗体（，）及 （美国 公司），、及 （美国 公司），（中国 公 司），、红细胞裂解液及细胞破膜液（美国 公司），羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（，）细胞增殖与示踪检测试剂盒、单抗偶联磁珠（美国 公司），人白细胞介素 （，）及人白细胞介素 重组蛋白（，；美 国 公司），人
6、外周血中性粒细胞分离液、瑞氏 姬姆萨复合染色试剂盒及 （中国 公司），荧光双染细胞凋亡检测试剂盒（中国杭州联贵 州 医 科 大 学 学 报 卷科生物技术股份有限公司），萤光酶联免疫斑点（，）试剂盒、肽段池（，；美国 公司），氨基放线菌素 （，）、标准透明 孔 型底细胞培养板 中国爱必信（上海）生物科技有限公司，磷酸盐缓冲液（，；中国兰杰柯科技有限公司），（）培养基、青霉素 链霉素混合液（中国武汉普诺赛生命科技有限公司），胎牛血清（，；中国浙江天杭生物科技股份有限公司），完全培养基配方为 青霉素 链霉素混合液 ，流式试管（墨西哥 公司），流式分选仪和流式细胞仪（美国 公司），型显微镜（日本 公司
7、），荧光酶联免疫斑点分析仪（德国 公司）。研究方法 血液标本抽取 术后患者移植完成后第 天时及健康供者任一时间点的空腹外周血。分离 与 细胞组受检者新鲜外周血标本置于 试管中，加预先放置的中性粒细胞分离液 ，室温下 离心 ，吸出分层的 层细胞（包含了所有白细胞），缓冲液洗涤 次（离心 ）。分选 与 细胞 取“”项下 组受检者白细胞置于 流式试管中，室温下 离心 ，缓冲液 重悬，分别加 及 细胞的分选抗体组合，即对于 使用 、及 ，对于 细胞则使用 、及 进行染色，常温避光孵育 ；缓冲液 洗涤细胞 次，加 红细胞裂解液 裂解红细胞，常温避光孵育 ；缓冲液洗涤，完全培养基重悬。遵循 手册建立无菌管
8、路，使用无菌生理盐水作为鞘液进行分选，承接分选细胞的无菌流式管中预先加 ，收集细胞数上限为 个 管；分选结束后立刻迅速将细胞转移至 、培养箱中备用。瑞氏 姬姆萨（，）染色取“”项下 组受检者 混匀滴至载玻片、推片、常温晾干，使用移液器悬滴 染色液（液）至载玻片、覆盖涂片区、常温孵育 ；滴加等量 缓冲液（液），晃动玻片与 液均匀混合，再使用 洗耳球充分混匀 、液，常温孵育 ；生理盐水洗去染色剂，玻片于常温晾干；用显微镜阅片（放大倍数为 倍），比较 术后患者及健康供者 形态学差异。检测 凋亡（法）取“”项下 术后患者 于室温 离心 ，用预冷 洗涤，离心 ；稀释 为 工作液，取 重悬细胞；流式试管中
9、加 和 ，涡旋混匀，室温避光孵育 ；运用 进行 细胞凋亡检测及分析，后续按 、时间点对 凋亡情况各检测 次。染色 孔 形板每孔加 抗 抗体 ，铝箔包裹 孔板，孵育过夜；取出 孔板，吸出残留的抗体，每孔加完全培养基 ，的 培养箱孵育 ，孵育的同时取“”项下 术后患者 细胞于室温下 离心 ；用 含有 染液的 缓冲液重悬并染色 细胞，室温避光孵育 ；加倍体积的完全培养基终止反应后于室温下洗涤 细胞，离心 ，重复上述洗涤 遍，重悬 细胞至 个 备用；孔板孵育结束后吸出培养基，根据实验设计加入不同比例（即 细胞 ，）染色完毕的 细胞及“”项下 术后患者 ，置于 的 培养箱共培养 ；共培养的第 天，每孔加
10、 和 增殖培养；共培养结束后收集各孔细胞，置于 流式试管，按照细胞表面标志物染色流程进行抗 、及 染色后流式上机判断 细胞增殖、分裂情况，采用 （美国 公司）软件进行量化比较。实验 酒精 孔加至 板中，室温避光孵育 ；去酒精，每孔中期陈璐等 细胞对异基因造血干细胞移植术后患者 淋巴细胞增殖及干扰素 分泌的影响加 缓冲液 洗涤，重复 次；加抗 抗体（），铝箔包裹 板，孵育过夜；取出 板，甩去残留抗体，每孔加 缓冲液 洗涤 遍，加含 的 封闭液，常温避光孵育 ；甩去封闭液，每孔加 缓冲液 洗涤 遍；各孔加“”项下 术后患者 个细胞 实验组加 个 （即 细胞 ），对照组不加入 （即 细胞 ），再加刺
11、激物 、可溶性 （种刺激物下的各组均设置 个孔），将 板置于 的 培养箱中共培养 ；甩去细胞，含 的 缓冲液 ，洗涤次，每孔加 ，室温避光孵育 ；含 的 缓冲液 ，洗涤 次，每孔加 ，室 温 避 光 孵 育 ；含 的 缓冲液洗涤 次，洗涤次；每孔加 稀释的 ，室温下避光孵育 ，用流动自来水终止反应；采用 分析仪对各孔 分泌情况进行拍照解读。结果 形态特征 术后患者 大多呈不成熟粒细胞表型，细胞核占胞质比例大，无明显分叶；健康供者 则呈成熟粒细胞表型，细胞核所占比例小，有明显分叶。见图 。患者 健康供者图 术后患者和健康供者 的形态学特征（染色，）（，）凋亡检测 术后患者部分 于 时出现早期凋亡
12、，时出现晚期凋亡，但大部分 于 时仍处于存活状态。见图 。图 术后患者 不同时间点的凋亡检测（）（）与 淋巴细胞共培养 染色实验结果显示（图 ），术后患者 可抑制由在 单抗偶联磁珠刺激下所引起的 细胞非特异性增殖，且这种抑制作用（以 细胞分裂指数表示）随着 细胞与 比例的升高而增强。检测结果显示（图 ），术后患者 可抑制 淋巴细胞在 或 刺激下 的释放。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷注：为共培养后荧光图，为 细胞分裂曲线图。图 术后患者不同比例 对 淋巴细胞增殖的影响（染色）（）注：褐色斑点表示 表达。图 术后患者 细胞中 的表达（法）（）讨论研究发现，多形核 有着粒细胞来源的特性，既不能
13、冻存，也不能使用人外周血淋巴细胞分离液（，）进行分离 。鉴于 的临床标本不易保存，因此对 的大量研究尚停留于动物模型阶段 ，。目前，围绕 并结合 后病人的临床预后及转归资料进行的探索屈指可数，而针对 与 的研究尚比较缺乏。等 在动物模型体内围绕 所展开的一系列研究发现 对 预 防 人 源 化 小 鼠 能够起到一定作用；等 在小鼠移植的同时回输 ，结果表明 可改善 严重程度，并使 评分从 下降至 。淋巴细胞可分为 辅助 淋巴细胞和 细胞毒性 淋巴细 胞 。一般认为，在 中主要发挥作用的是 淋巴细胞 。一方面，淋巴细胞受到抗原刺激后可发生增殖、分化，幼稚的 和 细胞分化期陈璐等 细胞对异基因造血干
14、细胞移植术后患者 淋巴细胞增殖及干扰素 分泌的影响为大量效应细胞，进入外周血并迁移到炎症组织以对抗感染或肿瘤 ；另一方面，淋巴细胞被抗原激活后立即行使杀伤、释放细胞因子等功能 。前一方面的作用，本研究采用 染色观察 对 淋巴细胞增殖情况的影响，结果表明 可抑制由 非特异性诱导的 细胞的增殖，而对 细胞并无明显抑制作用；后一方面的作用，本研究使用 进行评价，结果亦表明，可同时抑制由 非特异性诱导及 特异性诱导的淋巴细胞内细胞因子的释放。总之，上述结果可以说明 具有免疫抑制功能，这和广泛的动物研究结果认为 具有免疫抑制功能相符合 ，。综上所述，本研究表明 具有抑制 术后患者自身 淋巴细胞增殖及激活
15、的功能。因此，可以预见 在患者移植后早期可能降低了 发生率，并且缓解了 严重程度。这也就使得 在临床工作中作为 防治策略成为可能。参考文献 ，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）（），（）：，（）：，（）：，?，（）：，：，（）（），（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：（下转第 页）贵 州 医 科 大 学 学 报 卷关节炎大鼠 及 表达的影响 贵阳医学院学报，（）：，（）：，?，：仵恒立，谢天篪，张军阳，等 类风湿早期诊断 临床研究，（）：，（）：蒋海旭，许杰，陆清怡 槲皮素治疗类风湿关节炎的研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：吴宁，袁桃花，姬进忠，等 苗药验方四大血对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和焦亡的影响 南方医科大学学报，（）：（收稿，修回）中文编辑严征英文编辑张启芳（上接第 页），?，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，?，：（收稿，修回）中文编辑严征英文编辑陈琳贵 州 医 科 大 学 学 报 卷
