1、基金项 目:湖 北 省 科 技 厅 科 研 基 金 资 助 项 目(编 号:WJ2020M080)作者单位:428000 湖北省黄冈市中心医院消化内科(黄静,王菁);黄冈市中医院超声科(商惠民);武汉大学中南医院消化内科(周娟)第一作者:黄静,女,45 岁,大学本科,主治医师。E-mail:自身免疫性肝病不同肝组织炎症分级和纤维化分期的自身免疫性肝炎患者外周血单个核细胞 TLR2 和 CTLA-4 水平变化研究黄 静,商惠民,王 菁,周 娟【摘要】目的 调查不同肝组织炎症分级和纤维化分期的自身免疫性肝炎(AIH)患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll 样受体 2(TLR2)和细胞毒性 T
2、淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)水平变化。方法 2018 年 6 月 2022 年 6 月我院诊治的 47 例 AIH 患者和同期 50 例健康人,所有 AIH 患者接受肝活检。抽取外周血,分离 PBMCs,采用 PCR 法检测 PBMCsTLR2 和 CTLA-4 mRNA 水平,使用流式细胞仪检测 TLR2 和 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比。结果AIH 患者 PBMCsTLR2 mRNA 水平和细胞表面 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比分别为(1.70.4)和(34.27.9)%,均显著高于健康人【分别为(0.90.2)和(21.43.5)%,P0.05】,而 PBMC
3、s CTLA-4 mRNA 水平和细胞表面 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比分别为(0.50.2)和(2.30.8)%,均显著低于健康人【分别为(1.10.2)和(13.73.9)%,P0.05】;21 例肝组织 G3/G4 级患者 TLR2 mRNA 水平和细胞表面 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比分别为(1.90.3)和(37.25.7)%,均显著高于26 例 G1/G2级患者【分别为(1.50.3)和(30.56.2)%,P0.05】,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和细胞表面 CTLA-4 阳性的 PBMCs百分比分别为(0.30.1)和(1.90.6)%,均显
4、著低于 G1/G2 级患者【分别为(0.70.2)和(2.60.8)%,P0.05】;17 例肝组织 F3/F4 期患者 TLR2 mRNA 水平和细胞表面 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比分别为(1.90.3)和(37.65.3)%,均显著高于 25 例 F1/F2 期患者【分别为(1.60.3)和(32.94.2)%,P0.05】或 5 例 F0 期患者【分别为(1.30.2)和(28.71.9)%,P0.05】,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和细胞表面 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比分别为(0.30.1)和(1.80.6)%,均显著低于 F1/F2 期患者【分
5、别为(0.60.2)和(2.30.7)%,P0.05】或 F0 期患者【分别为(0.90.2)和(4.20.4)%,P0.05】。结论 AIH 患者 PBMCs TLR2 mRNA 和 TLR2 阳性的 PBMCs 百分比升高,而 PBMCs CTLA-4 mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的 PBMCs 百分比降低,并与肝组织炎症活动度和纤维化程度相关,值得进一步研究。【关键词】自身免疫性肝炎;外周血单个核细胞;Toll 样受体 2;细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4;病理学特征 DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.05.014 Changes of per
6、ipheral blood mononuclear cell TLR2 and CTLA-4 in patients with autoimmune hepatitisHuang Jing,Shang Huimin,Wang Jing,et al.Department of Gastroenterology,Central Hospital,Huanggang 428000,Hubei Province,China【Abstract】Objective The aim of this study was to analyze the changes of peripheral blood mo
7、nonuclear cell(PBMC)Toll-like receptor 2(TLR2)and cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4(CTLA-4)in patients with autoimmune hepatitis(AIH).Methods 47 patients with AIH and 50 healthy subjects were encountered in our hospital between June 2018 and June2022,and all patients with AIH received live
8、r biopsies.The peripheral blood was drawn for separation of PBMCs,the TLR2 andCTLA-4 mRNA in PBMCs were detected by PCR,and the percentages of TLR2 and CTLA-4 positive PBMCs were detected byflow cytometry.Results The PBMC TLR2 mRNA level and the percentage of TLR2 positive PBMCs in patients with AIH
9、 were(1.70.4)and(34.27.9)%,both significantly higher than(0.90.2)and(21.43.5)%,respectively,P0.05,whilethe PBMCs CTLA-4 mRNA level and the percentage of CTLA-4 positive PBMCs were(0.50.2)and(2.30.8)%,bothsignificantly lower than(1.10.2)and(13.73.9)%,respectively,P0.05 in healthy persons;the PBMC TLR
10、2 mRNAlevel and the percentage of TLR2 positive PBMCs in 21 AIH patients with grade G3/G4 were(1.90.3)and(37.25.7)%,bothmuch higher than(1.50.3)and(30.56.2)%,respectively,P0.05 in 26 AIH patients with grade G1/G2,while thePBMCs CTLA-4 mRNA level and the percentage of CTLA-4 positive PBMCs were(0.30.
11、1)and(1.90.6)%,both muchlower than(0.70.2)and(2.60.8)%,respectively,P0.05 in patients with G1/G2;the PBMC TLR2 mRNA leveland the percentage of TLR2 positive PBMCs in 17 AIH patientswith stage F3/F4 were(1.90.3)and(37.65.3)%,bothmuch higher than(1.6 0.3)and(32.9 4.2)%,respectively,P 0.05 in 25 patien
12、ts with stage F1/F2 or(1.30.2)and(28.71.9)%,respectively,P0.05 in 5patients without liver fibrosis,while the PBMCs CTLA-4 mRNA856实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5level and the percentage of CTLA-4 positive PBMCs were(0.30.1)and(1.80.6)%,both much lower than(0.60
13、.2)and(2.30.7)%,respectively,P0.05 in patients with stage F1/F2 or(0.90.2)and(4.20.4)%,respectively,P0.05)。本研究获得我院医学伦理委员会批准,患者签署知情同意书。1.2 肝活检常规对 AIH 患者行肝穿刺检查,肝组织炎症活动度分为 G1 G4 级,肝纤维化程度分为F1 F4 期9。根据界面破坏范围和细胞浸润程度,分为:轻度:局部或少数门管区被破坏;中度:50%门管区被破坏或纤维间隔形成;重度:50%门管区被破坏或纤维间隔形成。1.3 PBMCs TLR2 和 CTLA-4 mRNA 检测采
14、集空腹静脉血,使用淋巴细胞分离液(中国科学院天津试剂厂)和采用 Ficoll 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 得 到PBMCs,4冷藏、备用。采用 Trizol 法提取 PBMCs总 RNA,使用紫外分光光度计(美国 Thermo 公司)检测并记录总 RNA 浓度和纯度。使用逆转录试剂盒(FINNZYMES 公司)将总 RNA 逆转录为 cDNA。取cDNA,建立 20L 反应体系,行 PCR 扩增。TLR2 上游引物(上海生工生物公司)为 5-TTTGCTGGACT-TACCTTCCTTG-3,下游为 5-CAGTATCTCGCAGT-TCCAAACA-3;CTLA-4 上游引物(上海生
15、工生物公司)为 5-GACCAGGGACTCTACATCTGC-3,下游为 5-TCACATTCTGGCTCTGTTGG-3。PCR 反应如下:95 5 min,94 30 s,57 60 s,72 60 s,共35个循环。PCR 扩增产物经 2%琼脂糖凝胶(北京瑞达恒辉科技发展有限公司)电泳,计算 TLR2 和CTLA-4 mRNA 相对水平,以 2-Ct表示。1.4 PBMCs 表面 TLR2 和 CTLA-4 表达水平检测使用美国贝克曼 CytoFLEX 流式细胞仪检测 PBMCs表面 TLR2 和 CTLA-4 表达水平,抗体均购自美国BD 公司。1.5 统计学方法 应用 R 4.1.
16、2 软件进行统计学分析。对计量资料先行 Shapiro-Wilk 检验,判断是否服从正态分布。对符合正态分布者,以(xs)表示,采用 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组 PBMCs 和细胞表面 TLR2 和 CTLA-4 比较956实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5AIH 患者 PBMCs TLR2 mRNA 水平和 TLR2 阳性的细胞百分比显著高于健康人,而 PBMCs CTLA-4mRNA 水平和 CTLA-4 阳性的细胞百分比显著低于健康人(P0.05,表 1)。表 1 两组 PBMCs 和细胞表面 TLR2 和 CTLA-4(xs)比较例数细胞 mRNATLR2CTLA-4细胞表面TLR2(%)CTLA-4(%)AIH471.70.40.50.234.27.92.30.8健康人500.90.21.10.221.43.513.73.9 与健康人比,P0.052.2 不同病情严重程度的 AIH 患者 PBMCs TLR2 和CTLA-4 水平及表
