1、 收稿日期:作者单位:郑州大学附属郑州中心医院 心血管内科 心脏康复科河南 郑州 通信作者 :./.白桦脂酸调节/信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响毛治尉王东伟武永新张 涛 摘 要 目的探究白桦脂酸通过调节腺苷酸活化蛋白激酶()/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()/样自噬激活激酶()信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响方法原代培养冠心病大鼠血管平滑肌细胞将其随机分为正常组(组)、模型组(组)、低浓度(/)白桦脂酸组(组)、高浓度(/)白桦脂酸组(组)和高浓度(/)白桦脂酸 抑制剂(/)组(组)法检测大鼠血管平滑肌细胞的细胞活力 流式细胞术检测细胞凋亡 双荧光体系示踪大鼠血
2、管平滑肌细胞的自噬小体 实时荧光定量()实验检测大鼠血管平滑肌细胞中、的表达 实验检测大鼠血管平滑肌细胞中、蛋白表达水平结果与 组相比 组血管平滑肌细胞的细胞活力(、)、蛋白表达、和蛋白表达显著上升()细胞凋亡率、/、蛋白表达、及 和蛋白表达显著下降()与 组相比 组血管平滑肌细胞的细胞活力(、)、蛋白表达、和蛋白表达显著下降()细胞凋亡率、/、蛋白表达、及 和蛋白表达显著上升()减弱了白桦脂酸对血管平滑肌细胞自噬和凋亡的促进作用()结论白桦脂酸可能通过激活/信号通路促进冠心病大鼠血管平滑肌细胞的自噬和凋亡关键词 白桦脂酸腺苷酸活化蛋白激酶哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 样自噬激活激酶 血管平滑肌细胞
3、自噬凋亡冠心病 /()()/()/().()(/)()(/)()(/)(/)().().()()/().()()/().实用药物与临床 年第 卷第 期 .()./.:引言冠心病是目前世界范围内常见的心脏病之一是我国心脏病病例中住院率和死亡率最高的疾病类型 冠心病主要是由于冠状动脉粥样硬化导致冠脉痉挛和冠脉管腔狭窄改变使冠状动脉供血相对不足最终导致心肌细胞出现缺氧、缺血 血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞血管内皮炎症贯穿了冠状动脉粥样硬化的始终能引起血管平滑肌细胞异常增殖、凋亡、血管内皮损伤等 因此研究如何调节血管平滑肌细胞的功能对治疗冠心病具有重要意义 白桦脂酸是大量存在于桦木属植物如白桦树
4、皮中的一种五环三萜类化合物 药理学研究发现白桦脂酸具有抗炎、抗肿瘤、抗、抗溃疡等生物活性 但关于白桦脂酸在冠心病等心血管疾病中的作用和影响还鲜有报道 自噬是一种进化保守的分解代谢途径又被称为型程序性细胞死亡 研究发现激活腺苷酸活化蛋白激酶()/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()/样自噬激活激酶()信号通路可以促进细胞自噬 因此白桦脂酸能否通过调控该信号通路影响冠心病患者血管平滑肌细胞的生物学过程是值得探究的 本研究将以大鼠血管平滑肌细胞为研究对象探究白桦脂酸对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响和具体分子机制 材料与方法 实验动物 只 级 大鼠雄性 周龄体重 购自上海斯莱克实验动物有限公司许可证号
5、:(沪)所有大鼠实验前在温度 、相对湿度 、光照环境下饲养 本实验经郑州市中心医院动物伦理委员会批准(伦理号:)主要试剂与仪器白桦脂酸购自中国科学院成都生物研究所垂体后叶素购自南京新贝药业有限公司 高糖培养基、胎牛血清购自美国 公司、胰蛋白酶购自美国 公司 试剂盒购自日本同仁化学研究所 裂解液、蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司 试剂、反转录试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司平滑肌肌动蛋白()单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司 标记的 二抗购自北京中杉金桥公 司、一抗和相应二抗购自 公司 印迹电泳仪购自美国 公司 实验方法 大鼠冠心病模型的建立参考文献方法构建大鼠冠心病模型
6、将 只 大鼠随机分为对照组和模型组每组 只 对照组大鼠采用普通饲料正常饲养模型组大鼠每日使用高脂饲料进行喂养(含 猪油、基础饲料、胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶)连续喂养 周间隔 周大鼠腹腔注射垂体后叶素(/)次/连续注射 对照组大鼠注射等量的生理盐水 末次注射后 进行心电图检查出现 波高耸、段抬高超过 、心律不齐说明造模成功 血管平滑肌细胞的分离、培养与鉴定造模成功后处死所有大鼠解剖分别取两组 大鼠的胸主动脉血管平滑肌按组织贴块法进行培养 于含 胎牛血清的 高糖培养基、无菌培养箱中培养 使用 胰蛋白酶和 消化传代细胞 细胞传代 次后用于后续实验 在显微镜下观察细胞细胞应呈梭形或长梭形可以重叠生
7、长高低起伏呈“峰与谷”样生长状态 用 单抗通过免疫荧光染色法鉴定血管平滑肌细胞的特异性肌动蛋白 具体操作:用 多聚甲醛固定细胞后加入山 羊 血 清 孵 育 加 入 一 抗 单 抗()、标记的 二抗()、加入 工作液最后加入抗荧光猝灭剂在激光共聚焦显微镜下观察和拍照 细胞分组与处理细胞经鉴定为血管平滑肌细胞后取对数生长期血管平滑肌细胞以实用药物与临床 年第 卷第 期 .个/孔的密度接种于 孔板中待细胞贴壁后将从对照组大鼠中分离培养的血管平滑肌细胞记为正常组(组)将从模型组大鼠中分离培养的血管平滑肌细胞随机分为模型组(组)、低浓度(/)白桦脂酸组(组)、高浓度(/)白桦脂酸组(组)和高浓度(/)白
8、桦脂酸 抑制剂(/)组(组)继续培养 后加入相应药物进行处理 法检测细胞活力取对数生长期血管平滑肌细胞以 个/孔的密度将细胞接种于 孔板中继续培养 后对各组细胞进行分组并加入相应药物进行处理每组设置 个复孔 实验共设置 个检测时间点:、和 加入相应药物处理、后每孔加入 的 试剂继续培养 使用酶标仪检测 波长下每孔的光密度()值 值在一定程度上反映了细胞活力 细胞流式术检测细胞凋亡 取处理过的各组细胞加入胰酶消化离心弃去上清液收集细胞调整细胞悬液的密度为 个/加入 洗涤 次加入 重悬加入 和 试剂混匀后室温避光孵育 用流式细胞仪检测细胞凋亡 双荧光体系观察血管平滑肌细胞自噬小体 取对数生长期的血
9、管平滑肌细胞以 个/的密度接种在 孔板中当细胞汇合至后将 质粒转染至细胞中继续培养 后更换为完全培养基继续培养 将细胞按“”中进行分组和处理后继续培养 弃去培养基加入 多聚甲醛固定细胞 加入 染色剂对细胞核进行染色 在荧光显微镜下观察细胞内绿色和红色 的亮点(自噬体)的数量 实验检测大鼠血管平滑肌细胞中、的表达取对数生长期的血管平滑肌细胞进行相应分组与处理加入 试剂提取细胞 将提取的 按逆转录试剂盒说明书操作反转录为 并以此为模板进行 扩增 反应体系为 反应条件:预变性 变性 退火 一共循环 次 使用方法计算各组细胞、的表达量 引物序列设计如表 所示表 引物序列基因名称上游引物()下游引物()
10、检测大鼠血管平滑肌细胞中/信号通路和自噬相关蛋白表达 取对数生长期的血管平滑肌细胞进行相应分组与处理 加入 裂解液提取血管平滑肌细胞总蛋白使用 试剂盒测定蛋白质浓度 蛋白质样品进行 凝胶电泳随后被转移到 膜上 在室温下将膜在脱脂奶粉中封闭 随后在 下与一抗 ()、()、()、()、()、()、()、()孵育过夜 次日室温下将膜与相应二抗()孵育 再用 洗涤膜 次加入 显色剂进行显色 以 为内参使用凝胶图像处理系统分析目标蛋白的灰度值 统计学方法 采用 软件进行统计分析 符合正态分布的计量资料以 表示 多组间比较采用单因素方差分析进一步两两比较采用 检验 为差异具有统计学意义 结果 血管平滑肌细
11、胞的鉴定当培养至第 天时光镜下观察到细胞大部分呈长梭形小部分呈多角形或不规则形当培养至第 天时细胞呈典型的“峰谷”样结构(图)血管平滑肌细胞经免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察到标志性分子 在细胞质中沿纵轴呈丝状排列 在细胞质发出绿色荧光细胞核被染为蓝色表明所培养的细胞为血管平滑肌细胞(图)白桦脂酸对各组血管平滑肌细胞细胞活力的影响与 组相比 组细胞活力(、)显著升高()与 组相比 组细胞活力(、)显著降低()与 组相比 组细胞活力(、)显著降低()与 组相比 组细胞活力(、)显著升高()(图)实用药物与临床 年第 卷第 期 .图 原代培养血管平滑肌细胞形态()图 免疫荧光检测 在血管平滑肌细
12、胞中的表达()图 各组血管平滑肌细胞细胞活力的比较注:与 组相比 与 组相比 与 组相比 与 组相比 白桦脂酸对各组血管平滑肌细胞细胞凋亡率的影响与 组细胞凋亡率()相比 组细胞凋亡率()显著降低()与 组相比 组细胞凋亡率()显著增加()与 组相比 组细胞凋亡率显著增加()与 组相比 组细胞凋亡率()显著降低()(图)白桦脂酸对各组血管平滑肌细胞自噬的影响 使用双荧光体系观察血管平滑肌细胞中绿色和红色 颗粒(自噬体)结果显示组、组血管平滑肌细胞中无明显的自噬小体出现 组血管平滑肌细胞中出现了明显的自噬小体 组血管平滑肌细胞中的自噬小体较少 与 组相比 组血管平滑肌细胞中的自噬小体减少(图)实
13、用药物与临床 年第 卷第 期 .白桦脂酸对血管平滑肌细胞中、表达的影响与 组相比 组细胞中、表达显著降低()表达显著升高()与 组相比 组细胞中、表达显著升高()表达显著降低()与 组相比 组细胞中、表达显著升高()表达显著降低()与 组相比 组细胞中、表达显著降低()表达显著升高()(表)图 流式术检测血管平滑肌细胞凋亡表 各组血管平滑肌细胞中、表达比较()组别 组.组.组.组.组.注:与 组相比 与 组相比 与 组相比 与 组相比 白桦脂酸对血管平滑肌细胞中/信号通路和自噬相关蛋白表达的影响与 组相比 组血管平滑肌细胞中、/、蛋白表达显著降低()、蛋白表达显著升高()与 组相比组血管平滑肌
14、细胞中、/、蛋白表达显著升高()、蛋白表达显著降低()与 组相比 组血管平滑肌细胞中、/、蛋白表达显著升高()、蛋白表达显著降低()与 组相比 组血管平滑肌细胞中、/、蛋白表达显著降低()、蛋白表达显著升高()见表 及图 表 各组血管平滑肌细胞中/信号通路和自噬相关蛋白表达的比较()组别/组.组.组.组.组.注:与 组相比 与 组相比 与 组相比 与 组相比 实用药物与临床 年第 卷第 期 .图 双荧光体系观察血管平滑肌细胞中的自噬小体注:最右侧一列为左侧圈中部分的放大图图 检测血管平滑肌细胞中/信号通路和自噬相关蛋白表达 讨论冠心病多发病于 岁以上的人群是临床常见的心血管疾病之一且致死率在心
15、血管疾病中最高严重威胁着人类的生命健康 目前临床治疗冠心病主要依靠腔内介入和旁路血管移植术这两种治疗手段在提高患者近期疗效中效果较好但长期预后较差容易受到冠脉再狭窄的制约 因此寻找治疗冠心病安全有效的药物在提高疗效的同时提高患者预后是亟待解决的重要课题之一 研究显示血管平滑肌细胞是构成冠状动脉血管壁的肌层部分在冠心病的病理状态下平滑肌细胞异常增殖合成并分泌胶原纤维蛋白进一步促进管腔狭窄和管壁硬化 血管平滑肌细胞主要有 种表型:收缩型和分泌型 正常生理状态下血管平滑肌细胞为收缩型能够维持血管的张力在病理状态下血管平滑肌细胞转化为分泌型具有强大的增殖能力和迁移活性实用药物与临床 年第 卷第 期 .
16、因此深入研究血管平滑肌细胞的生物学功能对治疗冠心病具有重要作用 细胞自噬是一种溶酶体的降解途径对细胞生存、分化和机体发育、稳态具有重要作用 研究发现自噬在感染、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等疾病中起到保护作用当自噬水平减弱可能会导致阿尔茨海默病、心血管疾病的发生、是自噬发生过程中的重要蛋白其蛋白表达量可以作为自噬发生的标志 本研究采用高脂饮食构建冠心病大鼠模型从冠心病大鼠的胸主动脉血管平滑肌中分离培养原代血管平滑肌细胞经鉴定所培养的 细 胞 为 血 管 平 滑 肌 细 胞 结 果 显 示 与组相比 组血管平滑肌细胞的细胞活力(、)、蛋白表达显著上升细胞凋亡率、/、蛋白表达显著下降表明模型建立成功白桦脂酸是一种天然的五环羽扇烷结构的三萜化合物主要从桦木科的树皮中提取而来相关研究表明白桦脂酸能够增强细胞自噬而发挥治疗相关疾病的作用 如白 桦 脂 酸 能 通 过 信号通路增强自噬抑制脊髓细胞焦亡促进脊髓损伤的恢复 等研究 表 明 白 桦 脂 酸 通 过/信号通路诱导人膀胱癌细胞自噬依赖性凋亡 本研究结果显示与 组相比 组血管平滑 肌 细 胞 的 细 胞 活 力(、)、蛋白表达显著下降细胞
