1、 2023 年 8 月 第 38 卷 第 4 期JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY Vol.38 No.4 Aug.2023收稿日期:2023-01-05;修回日期:2023-04-19;出版日期:2023-08-15基金项目:山东省重点研发计划项目(2021LYXZ018,2020CXGC010604);齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程重大创新专项项目(2022JBZ01-08)作者简介:王瑞雪(1996),女,山东省临沂市人,齐鲁工业大学硕士研究生,主要研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:437573166 通信作者:李迎秋(1972),女,山东
2、省菏泽市人,齐鲁工业大学教授,博士,主要研究方向为食品生物技术。E-mail:lyq 王瑞雪,李迎秋.CaCl2预处理对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响J.轻工学报,2023,38(4):46-52,60.WANG R X,LI Y Q.Effect of CaCl2 pretreatment on structural characteristics of TGase-induced mung bean protein gels J.Journal of Light Industry,2023,38(4):46-52,60.DOI:10.12187/2023.04.006CaCl2
3、预处理对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响 王瑞雪,李迎秋齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院,山东 济南 250353摘要:以转谷氨酰胺酶(TG 酶)诱导的绿豆蛋白凝胶(MBPG)为研究对象,探究不同浓度 CaCl2预处理对 TG酶诱导的 MBPG 结构特征的影响。结果表明:TG 酶诱导的 MBPG 蛋白条带的强度均随着 CaCl2浓度的增加而增强;低 CaCl2浓度(20 mmol/L)导致 TG 酶诱导的 MBPG 游离巯基和离子键含量均降低,表面疏水性增强,氢键和二硫键含量均增加;高 CaCl2浓度(20 mmol/L)使得游离巯基和离子键含量均增加,表面疏水性减弱,
4、氢键含量降低;CaCl2预处理使 TG 酶诱导的 MBPG 二级结构从-螺旋和-转角转化为-折叠和无规则卷曲。CaCl2预处理可改变 TG 酶诱导的 MBPG 结构特征,为 MBPG 配方食品的开发提供参考。关键词:CaCl2;转谷氨酰胺酶;绿豆蛋白凝胶;结构特征中图分类号:TS201.7 文献标识码:A 文章编号:2096-1553(2023)04-0046-080 引言绿豆蛋白中的必需氨基酸(如赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等)含量丰富,可满足人体对氨基酸的需求1。另外,绿豆蛋白及其多肽还具有抗氧化、抗真菌、抑制血管紧张素转换酶活性等功效2。然而,绿豆蛋白的溶解性、乳化性、凝胶性等功能特
5、性均较差3-4,限制了其在食品加工工业中的应用范围。蛋白质凝胶可保留水分及与颜色和风味有关的化合物,也可作为微量营养素及其他活性成分的输送载体5,其形成能力取决于结构、浓度、环境因素(如温度、压力、酶活性、化学成分(pH 值和盐离子)等)等6。转谷氨酰胺酶(TG 酶,EC 2.3.2.13)是一种转移酶,可催化谷氨酰胺残基(Gln)中的-羟胺基与赖氨酸残基(Lys)中的-氨基之间的酰基转移反应,导致共价-(-Gln)-Lys 异肽键形成及分子间或分子内交联7,从而使蛋白质(如乳清蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、肌原纤维蛋白等)表现出更强的保水性和凝胶性8。盐离子是影响蛋白质凝胶性的主要因素
6、之一,在凝胶形成和风味释放中均起着重要作用。J.X.Yan 等9研究发现,Ca2+64 王瑞雪,等:CaCl2预处理对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶结构特征的影响(20 mmol/L)的加入可使高粱阿拉伯木聚糖-大豆分离蛋白混合凝胶的网络结构变得规则有序,并能有效增强混合凝胶的力学强度;随着 Ca2+浓度(20 mmol/L)的增加,混合凝胶网络结构变得紊乱和粗糙,弹性、黏性和咀嚼性均显著降低。Y.Q.Xiao 等10研究发现,随着 Ca2+浓度的增加,纤维素纳米晶体-乳清分离蛋白复合凝胶的凝胶强度、黏弹性和热稳定性均逐渐升高。虽然 TG 酶和 Ca2+已成功应用于改善某些食品蛋白质的凝胶性,但
7、关于Ca2+对 TG 酶诱导的绿豆蛋白凝胶(MBPG)的影响机制研究尚无报道。基于此,本文拟用不同浓度的 CaCl2溶液预处理绿豆蛋白,用 TG 酶诱导制备 MBPG,并根据其十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白条带、游离巯基含量、表面疏水性、傅里叶红外光谱(FTIR)和分子间作用力,研究 CaCl2预处理对 TG酶诱导的 MBPG 结构特征的影响,以期从结构角度揭示 CaCl2对 TG 酶诱导的 MBPG 凝胶特性的影响机理,并为改善 MBPG 凝胶特性提供理论参考。1 材料与方法1.1 主要材料与试剂去皮绿豆(蛋白质含量约 36%、脂肪含量约1%、碳水化合物含量约 15
8、%),山东返璞食品有限公司;TG 酶(酶活性为 120 U/g),山东朗科特酶制剂有限公司;CaCl2(96.0%)和其他常用试剂,均为分析纯,国药控股化学试剂有限公司。1.2 主要仪器与设备YT2204 型电子分析天平,苏州正峰电子科技有限公司;S10-3 型搅拌器,上海司乐仪器有限公司;HH-2 型数显恒温水浴锅,常州天瑞仪器有限公司;5804R 型高速离心机,德国艾本德股份公司;K9860型全自动凯氏定氮仪,海能仪器有限公司;F2700 型荧光分光光度计,日本日立公司;UV-9000 型紫外分光光度计,上海美泰仪器公司;Nicolet iS10 型傅里叶红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技公司
9、。1.3 实验方法1.3.1绿豆蛋白制备将去皮绿豆研磨成粉末(水分含量(10.90.98)%),按 m(绿豆粉末/g)V(去离子水/mL)=1 15 的比例溶于去离子水中,用 NaOH 溶液(1.0 mol/L)调 pH 值至 9.0;在 40 条件下连续搅拌 2 h,再于 4000 r/min、25 条件下离心 10 min,收集上清液;用 1.0 mol/L HCl 溶液将上清液 pH 值调至 4.5(蛋白质等电点),再次离心,收集蛋白质沉淀;用去离子水清洗蛋白质沉淀并离心 3 次;调整蛋白质沉淀重悬浮溶液(m(蛋白质沉淀/g)V(去离子水/mL)=1 10)的 pH 值至 7.0后,对其
10、进行冷冻干燥,即获得绿豆蛋白11。绿豆蛋白得率为(31.681.56)%,凯氏定氮法测得绿豆蛋白纯度为(87.981.24)%12。1.3.2 MBPG 制备配制浓度分别为 0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L 和40 mmol/L 的 CaCl2溶液;在不同 CaCl2溶液中添加绿豆蛋白制备质量分数为 18%的绿豆蛋白溶液,并于室温下搅拌 1 h;将 TG 酶与绿豆蛋白溶液混合,使 TG 酶的酶活性为 30 U/g,于 40 水浴中孵育1 h,再于95 条件下加热30 min 后,立即于冰水中冷却 10 min,并于 4 条件下放置
11、24 h,即得MBPG。对 MBPG 进行冷冻干燥,备用。1.3.3 SDS-PAGE 测定 采用 12%的分离胶和 3%的浓缩胶进行 SDS-PAGE。将 10 mg 冷冻干燥的MBPG 样品加入 1 mL 还 原 性 样 品 缓 冲 液(含50 mmol/L Tris-HCl、10 mg/mL SDS、体积分数为10%的甘油、0.2 mg/mL 溴酚蓝和体积分数为 1%的-巯基乙醇,pH 值为 8.0)中,于 100 条件下加热3 min;分别取 10 L MBPG 样品和蛋白质 Mark(相对分子质量为 11245 kDa)加入浓缩胶槽,在运行缓冲液(含 50 mmol/L Tris、3
12、84 mmol/L 甘氨酸和1 mg/mL SDS,pH 值为 8.3)中先以 80 V 电压运行30 min,再以 120 V 电压运行 2 h。电泳结束后,先将凝胶置于固定液中固定 2 h,再用 2.5 mg/mL 考马斯亮蓝 R-250 溶液染色 2 h,最后用脱色液脱色,直至蛋白条带变清晰11。1.3.4 游离巯基含量测定将 50 mg 冷冻干燥的MBPG 样品溶于 5 mL Tris-Gly 缓冲液(含 86 mmol/L Tris、90 mmol/L 甘氨酸和 4 mmol/L EDTA,pH 值为 8.0)中,于 25、10 000 r/min 条件下离心 10 min;取 3
13、mL 上清液,与 30 L 4 mmol/L 的 Ellmans 试74 2023 年 8 月 第 38 卷 第 4 期剂(5,5-二硫双-2-硝基苯酸溶于 Tris-Gly 缓冲液)混合,置于暗处孵育 1 h 后,在 412 nm 处测定其吸光度13。MBPG 游离巯基含量计算公式为:游离巯基含量=73.53 A412 DC式中,73.53 为 106/13 600(13 600 为 Ellmans 试剂的摩尔吸光度),A412为混合物在 412 nm 处的吸光度,D 为 稀 释 系 数,C 为 MBPG 质 量 浓 度/(mg mL-1)。1.3.5 表面疏水性测定将冷冻干燥的 MBPG
14、样品分散于 0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液(pH 值为7.0)中,稀释至 0.05 mg/mL;取 4 mL 稀释溶液与20 L 8.0 mmol/L 的 ANS 溶液(8-苯胺-1-萘磺酸溶解于 0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液中,pH 值为 7.0)混合后,在黑暗中贮存 20 min。用荧光分光光度计测定反映 MBPG 表面疏水性的荧光强度14,设置激发波长和发射波长分别为 374 nm 和 485 nm。1.3.6 FTIR 测定将 2 mg 冷冻干燥的 MBPG 样品于 198 mg KBr 一起研磨,压成 12 mm 的薄片;将该薄片在 4004000 cm-1的波数内扫描
15、64 次,分辨率为 4 cm-115。使用 Peakfit v4.12 分析蛋白质的二级结构。1.3.7 分子间作用力测定将 50 mg 冷冻干燥的 MBPG 样品分别分散于 5 mL S1 溶液(含 0.6 mol/L NaCl 溶液)、5 mL S2 溶液(含 0.6 mol/L NaCl 和1.5 mol/L 尿素溶液)、5 mL S3 溶液(含 0.6 mol/L NaCl 和 8 mol/L 尿 素 溶 液)及 5 mL S4 溶 液(含 0.6 mol/L NaCl、8 mol/L 尿素和 0.5 mol/L-巯基乙醇溶液)中;将分散体置于室温下孵育 1 h,于 25、8000 r
16、/min 条件下离心 20 min;以牛血清白蛋白为标准品,采用 Lowry 法测定上清液中的可溶性蛋白含量16。S1、S2-S1、S3-S2 和 S4-S3 的溶解度分别代表离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键的贡献17。1.4 数据处理与分析实验至少重复 3 次,数据结果以(平均值标准差)表示。使用 IBM SPSS Statistics 23 软件进行单因素方差分析和邓肯多重范围检验,以确定组间差异显著性(P100 kDa)的形成。一些聚合物保留在堆积凝胶中,不穿透分离凝胶。这可能是 TG 酶催化的谷氨酰胺和赖氨酸反应残基共价交联后的蛋白质聚集所致18。随着 CaCl2浓度的增加,TG 酶诱导的 MBPG 蛋白条带强度均增强。这可能是因为CaCl2可促进 TG 酶诱导的 MBPG 蛋白质聚集体的解离,形成不同相对分子质量的蛋白质亚基19。该结果与王家琛20的研究结果较一致。图 1 CaCl2预处理对 TG 酶诱导的MBPG SDS-PAGE 的影响Fig.1 Effect of CaCl2 pretreatment on the SDS-PAGE of TGase-induced
