1、 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 基础研究 通路在胃癌生长中的作用及其机制孙颖，王吉，郑雄，顾玮，胡梅洁【摘要】目的探讨 通路在胃癌生长中的作用及其机制。方法选取 年 月至 年 月入上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院行胃癌切除手术的癌组织及癌旁组织标本 对，采用实时荧光定量 检测组织和细胞中 和 的表达，检测胃癌细胞 增殖，检测胃癌细胞 迁移，流式细胞仪检测胃癌细胞 凋亡和细胞周期，荧光素酶报告基因检测 和 及 和 之间的相互作用。结果胃癌组织中 的水平明显高于癌旁组织；胃癌组织中 的水平明显低于癌旁组织；与 相比，胃癌细胞系 、中 表达明显升高，胃癌细胞系 、中 表达明显
2、降低；与 组相比，组中的 表达明显降低，表达显著升高；与 组相比，组细胞增殖能力、迁移数量显著降低，细胞凋亡率、期细胞比例及 蛋白表达显著增加，期细胞比例显著降低；与 组相比，抑制剂组的细胞增殖能力、迁移数量明显升高，细胞凋亡率、期细胞比例及 蛋白表达明显降低，期细胞比例明显上升，与 组相比，组中的相对荧光素酶活性显著降低，减少 荧光素酶活性。结论 通路在胃癌的发生发展中起着至关重要的作用，可能成为胃癌诊断及治疗的新靶点。【关键词】胃癌；中图分类号：文献标志码：作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院消化内科通信作者：王吉，：基金项目：上海市黄浦区卫健委科研项目（）；上海市卫生健康委员
3、会科研项目（）牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 【】牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 牞 【】牷 牷 牷 胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，具有高度侵袭性和异质性，是我国第二大癌症死亡原因 。尽管胃癌的治疗已逐步完善，但治愈率仍较低。由于早期缺乏明显的临床症状，大部分患者确诊时已届晚期，失去了手术治疗的机会。因此，探寻其进展的分子机制，确定新胃癌诊断分子标志物和治疗靶点，对提高胃癌患者生存质量具有重要意义。是一类内源性非编码 ，近年来大量研究表明，在人类疾病尤其是肿瘤的发生和发展中起着重要作用，可作为疾病诊
4、断和治疗的潜在分子标志物 。随着 序列技术和生物信息学的发展，揭示了 的多种功能。相关研究表明，的表达缺失可能是导致癌症发生的原因 ，另有研究发现，环状 在胃癌组织中表达上调，且其作为 家族成员的海绵，能够促进胃癌细胞增殖 。在前期研究中，我们通过微阵列分析获得胃癌和非癌组织中 及 的表达谱。从 数据库中获得 的表达谱，用 进行分析，鉴定出失调的 和 ，并构建了一个 调控网络，发现 在该网络中起着核心作用。因此本研究通过细胞学实验探索 在胃癌细胞中的生物学功能，明确 在胃癌中对相应 及其下游靶基因的调控作用，解释其参与胃癌发生发展的具体分子机制，探讨 是否可成为胃癌有效治疗的候选靶点，为提高胃
5、癌的生存率开辟新思路。材料和方法 主要试剂和仪器 培养基来自上海浩然公司，胎牛血清来自美国 公司，细胞迁移 小室来自美国 公司，胰酶来自美国 公司，缓冲液及 试剂盒来自美国 公司，、来自上海云序生物科技有限公司。全自动多功能酶标仪来自美国 ，细胞培养箱来自上海博讯公司，纯水仪来自美国 公司，超速离心机来自美国贝克曼库尔特有限公司。材料来源选取 年 月至 年 月入上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院行胃癌切除手术的癌组织及距离肿瘤边缘 以上的癌旁组织标本 对，其中男 例，女 例。纳入标准：患者经临床和病理确诊为胃癌，术前未经过放化疗、生物治疗及中医治疗等，未合并其他恶性肿瘤和心衰、肝脏疾病、肾
6、功能障碍等。标本采集通过本院伦理委员会批准，并获得患者以及家属知情同意。胃癌细胞 、和 及人正常胃黏膜上皮细胞（）来自中科院细胞库。方法 细胞培养胃癌细胞 、和 及 在 （含有 ）培养基中，所有细胞均置于 含 培养箱中，每隔两天更换新鲜培养基。细胞转染和分组将胃癌细胞 接种于细胞培养板中，将 细胞分为 组（将 转染至胃癌细胞 ）、组（将 转染至胃癌细胞 ）、组（将 和 共同转染至胃癌细胞 ）、抑制剂组（将 和 共同转染至胃癌细胞 ）、组（将 转染至胃癌细胞 ）及 组（将 转染至胃癌细胞 ），以 种于 孔板中，后，使用 转染试剂进行转染，培养 后进行相应的后续实验。实时荧光定量 检测 和 的表达
7、按照 说明书步骤提取胃癌组织中和细胞中的 ，采用 分光光度仪对 样品的浓度和纯度进行检测，纯度介于 的范围为合格，采用 逆转录试剂盒对组织和细胞的 样本进行逆转录为 ，按照试剂盒说明进行实时荧光定量 检测实验。上游引物：，下 游 引 物：，上游引物：，下游引物：，设置 个复孔，上下游引物、模板，加 水至总体积为 。反应条件为 ，；变形 ，；退火 ，；延伸 ，；循环 次。通过 法对基因相对表达量进行处理分析。检测胃癌细胞 增殖常规复苏细胞系 ，正常培养细胞，选取生长良好的细胞，消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为 。接种到 孔板，每孔接种 细胞悬液进行培养（每孔 细胞）。次日起每天选取对照组及敲除
8、组各 个培养孔，分别加入 溶液 ，继续孵育 终止培养，吸出孔内上清，每孔加入 室温震荡 ，使结晶充分溶解，于实验孔平行设置不加细胞只加培养液的空白对照孔。酶标仪上选择 波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度（），连续测 天。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标做生长曲线图。检测胃癌细胞 迁移细胞培养 后，胰酶消化并计数，每个样品细胞密度为 。离心后，重悬浮于 无血清培养基。湿润小室，将 预热的无血清培养基加入到小室中，常温放置，将 膜湿润。去掉小室中的培养基，在小室的孔中加入 下层培养液，用镊子将小室轻轻放入预先加好 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 培养基的孔中。小室上层加入 上层培
9、养液。每个样品取 （）加入到小室中，培养箱中培养。培养箱中培养 后，取出小室。用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉；孔板中，滴入 滴染色液；常温放置 ，进行染色；用去离子水洗 次；用棉棒去小室内边缘残留的细胞；显微镜下拍照，使用 软件进行细胞计数。流式细胞仪检测胃癌细胞 凋亡将细胞培养液移入 管内，洗涤，胰酶细胞消化。室温孵育后，吸除胰酶细胞消化液。加入细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，离心 ，弃上清，收集细胞，重悬细胞并计数，调整待测细胞的密度为 。细胞悬液加入 冷 ，轻轻震荡使细胞悬浮，离心 。重复两次。用 的 重悬细胞；加入 和 ，轻轻混匀，避光孵育 ；加入 标记缓冲液（试剂盒），立即使用
10、流式细胞仪检测。流式细胞仪激发光波长用 ，用一波长为 的滤器检测 荧光，另一波长 的滤器检测 荧光。流式细胞仪检测胃癌细胞 周期将细胞培养液移入 管内，洗涤，胰酶消化。室温孵育，弃胰酶细胞消化液。加入细胞培养液，混匀，转移到离心管内，离心 ，弃上清，收集细胞。细胞悬液加入 冷 ，轻轻震荡使细胞悬浮，离心 ，弃上清，重复 次。在细胞沉淀中加入 缓冲液，再加入 无水乙醇，即使用 预冷的乙醇固定细胞，固定细胞结束后，离心 ，弃上清。离心收集细胞，以 的 洗涤细胞一次，加入 含 溴化乙锭（）（），（），（），避光孵育 。待孵育完成后，用 目筛网过滤细胞至上机管中即可上机检测，并分析细胞周期的分布情况。
11、荧 光 素 酶 验 证 结 合 位 点 通 过 和 预测 和 及 和 的潜在结合位点。将野生型（）或突变型（）和 亚克隆至 荧光素酶报告载体 中，分 别 命名 为 、和 ，分别和 、转染到胃癌细胞 中，后，采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。检测 蛋白表达取胃癌细胞 ，在 孔板中加入 裂解液，冰上静置裂解，使用细胞刮刮出裂解混合物，并转移至 管内，将裂解混合物置离心处理，吸取上清到新的 离心管中，并检测蛋白浓度。然后 电泳、转膜和封闭，膜放入相应稀释的 抗体，置于 孵育过夜，中摇动洗涤 次。按照一抗属性稀释二抗溶液，将 膜放入孵育盒中室温孵育。中摇动洗涤次。使用增强型化学发光试剂显影，并用
12、化学发光成像分析系统曝光，保存图像。统计学处理采用 软件进行处理，计量资料符合正态分布的采用（珋 ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验，两组之间采用独立样本 检验，以 为差异有统计学意义。结果 和 在胃癌组织及胃癌细胞中的表达胃癌组织中 的水平明显高于癌旁组织（），差异具有统计学意义（），见图 ；胃癌组织中 的水平明显低于癌旁组织（），差异具有统计学意义（），见图 ；及胃癌细胞系 、及中 表达分别为（）、（）、（）、（）和（），见图 。与 相比，胃癌细胞系 、中 表达明显升高（），及胃癌细胞系 、及中 表达分别为（）、（）、（）、（）和（），与 相比，胃癌细胞系 、中
13、表达明显降低（），见图 ，因此选择 细胞作为本次实验。敲减 对 和 表达的影响与 组相比，组中的 表达明显降低（，），表达显著升高（，），见图 和 。图 胃癌组织及胃癌细胞中 和 的相对表达与癌旁组织相比，与 相比，。现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 敲减 对胃癌细胞 增殖的影响 实验表明，与 组相比，组 的细胞增殖能力显著降低（），与 组相比，抑制剂组 的细胞增殖能力明显升高（），见图 。图 和 的相对表达 敲减 对胃癌细胞 迁移的影响 实 验 表 明，与 组 相 比，组的细胞增殖迁移数量显著降低（），与 组相比，抑制剂组细胞增殖迁移数量明显升高（），见图 和表 。图 各组胃癌
14、细胞 增殖情况表 各组细胞的迁移、凋亡和细胞周期情况分组迁移数量（个）凋亡率（）细胞周期（）组 组 组 抑制剂组 图 各组胃癌细胞 迁移情况 敲减 对胃癌细胞 凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，与 组相比，组的细胞凋亡率显著增加（），与 组相比，抑制剂组细胞凋亡率明显降低（），见图 和表 。图 各组胃癌细胞 凋亡情况 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 敲减 对胃癌细胞 周期的影响流式细胞仪检测结果显示，与 组相比，组细胞中 期细胞比例显著增加（），期细胞比例显著降低（），但 期细胞比例无显著变化（）；与 组相比，抑制剂组细胞中 期细胞比例明显降低（），期细胞比例明显上升（），但
15、期细胞比例无显著变化（），见图 和表 。图 各组胃癌细胞 周期情况 荧光素酶结合靶点验证将 荧光素酶报告质粒转染到 组中，与 组（）相比，组（）中的相对荧光素酶活性显著降低（），而突变型 转染对荧光素酶活性无明显影响（），见图 和 。图 与 靶点预测与 组比，。通过 靶向调节 的表达通过 数据库预测简单 下游靶基因 ，见图 ；双荧光素酶报告基因结果表明，减少 荧光素酶活性（，），而对 荧光素酶活性无明显影响（，），见 图 ；检 测 结 果 显 示，与 组 相 比，组中的 蛋白明显降低（，）；与 组相比，组的 蛋白显著增加（，），与 组相比，抑制剂组 蛋白明显降低（，），见图 。讨论胃癌属于高发
16、癌症，对人类的健康构成较大的威胁，因此探寻胃癌治疗中靶向的、异常表达变化的关键靶点具有至关重要的作用。随着研究的不断进展，先后发现了人类多种疾病与 分子有着密切的关系。分子具有高度的稳定性，在组织细胞中均有表达，序列在物种中高度保守，同时能够抵抗核糖核酸酶 。又由于 独特的生化特征，有望成为肿瘤的新型生物标志物 。随着高通量测序的发展，生物芯片技术的进步，对 认识不图 与 预测位点以及对 表达的影响现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 图 敲减 以及抑制 后 的表达水平断的深入研究发现，在胃癌中越来越多的 失调并可能是潜在的调控胃癌的发生和发展的因素，作为促癌基因或者抑癌基因在胃癌中发挥着重要作用。研究发现，与正常组织相比，胃癌组织中有 种被下调，种被上调 。高敏等 研究表明，可能对胃癌的诊断具有一定参考价值，可能促进胃癌细胞发生发展，并有望成为胃癌诊断的生物标志物。王亚东等 研究显示，在胃癌细胞株、组织中呈高表达，作为 的海绵上调 促进胃癌细胞的生物学功能；含量下调后可显著抑制胃癌细胞增殖、迁移并诱导其凋亡。上述研究均说明 在胃癌的发生发展中发挥作用，可将其作为胃癌相关的标
