1、天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1364-1371Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究周艳，宿宿露，王云,范韦佟,李洪梅,李蓉涛,刘昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明6 50 50 0摘要：本研究对从蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）和赤芍（PaeoniaeRubra Radix）中分离的一种苯丙素类化合物ferulaldehyde的抗甲型流感病毒的作用机制进行探索。通过加药时间点、免疫荧光实验、红细胞凝集法与神经氨酸酶活力检测等实验，发现化合物ferulaldehyde主要影响流感病毒的复制和释放环节，干扰病毒的生命周期从而发
2、挥抗流感病毒活性。分子对接结果进一步确认流感病毒NP和NA蛋白很可能是它作用的靶点。同时,该化合物还能显著抑制由流感病毒引起的巨噬细胞炎症相关蛋白和趋化因子的表达。综上所述，化合物ferulaldehyde可能通过直接抑制流感病毒复制和释放的过程以及影响免疫细胞的功能从而发挥抗流感的作用。关键词:ferulaldehyde;苯丙素；病毒复制周期；炎性相关蛋白；抗流感病毒中图分类号：R962D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.8.009刘丹*文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)8-136 4-0 8Study on the anti-in
3、fluenza effect of ferulaldehyde in vitroZHOU Yan,SU Lu,WANG Yun,FAN Wei-tong,LI Hong-mei,LI Rong-tao,LIU DanFaculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,ChinaAbstract:To investigates the mechanism of ferulaldehyde,a phenylpropanoid compound isola
4、ted from Valeriana jatamansiJones and Paeoniae Rubra Radix,against influenza A virus.Through experiments such as dosing time point,immunofluores-cence,red blood cell agglutination,and neuraminidase activity detection,it was found that feruladehyde mainly affected thereplication and release of influe
5、nza virus,interfering with the life cycle of the virus,thereby exerting its anti-influenza virus ac-tivity.Molecular docking simulation confirmed that NP and NA might be the targets of the compound anti-influenza virus.Inaddition,the compound significantly inhibited the expression of macrophage infl
6、ammation-associated proteins iNOS and COX-2 and chemokine IP-10 induced by influenza virus.In conclusion,the compound ferulaldehyde might exert anti-influenzaeffects by directly inhibiting influenza virus replication and release and by affecting the function of immune cells.Key words:ferulaldehyde;p
7、henylpropanoid;virus replication cycle;inflammation-associated proteins;anti-influenza virus流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,具有季节性和流行性的特点。流感病毒属于正粘病毒科,分为A型、B型、C 型和D 型四种类型。预防和治疗流感,疫苗和抗病毒药物仍是最有效的选择。就降低发病率和死亡率而言,疫苗被认为是控制流感病毒大流行最理想的方法2】。然而,流感疫苗只有在疫苗毒株与流行性病毒株相匹配时才有效3。流感最常见的临床治疗药物主要是NA 抑制剂,包括奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦，以及M2质子通道阻滞
8、剂,包括金刚烷胺和金刚乙胺4。不幸的是，一些新出现的甲型流感病毒株，自然携带药收稿日期：2 0 2 2-12-15基金项目：国家自然科学基金（8 2 2 0 42 48）*通信作者 E-mail:物突变基因,导致对这些药物产生耐药性5。因此寻找新型抗流感药物刻不容缓。流感病毒感染机体后可触发各种免疫反应,引起调控细胞因子如肿瘤坏死因子-（T NF-）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)等的释放,而过度的免疫反应也会导致靶器官的炎性损伤,甚至影响脏器功能。据此,降低由流感病毒引起的炎性损伤也是治疗流感的一个主要方面6 苯丙素类是天然存在的一大类化合物,包括苯丙醇、苯丙醛、苯丙
9、酸、香豆素、木质素等,现代药理研究发现这类化合物具有减轻氧化应激损伤、抗肿瘤以及抗流感病毒的作用。有研究证明，中药制剂接受日期:2 0 2 3-0 4-18板蓝根的抗流感的作用也与其中的苯丙素类成分密切相关。苯丙素类小分子化合物ferulaldehydeVol.35（FD E）7 广泛存在于甘草、神经脂草、洋甘菊等植物中，被报道具有抗氧化和抗炎的活性8 。我们从蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）和赤芍（PaeoniaeRubra Radix）中都分离获得了FDE结构，并首次发现了其显著的抗流感病毒的作用。蜘蛛香和赤芍作为我国传统中药,药用历史悠久，在流感治疗方面也有相
10、关的记载，因此从中筛选有效化合物并研究其活性成分的作用机理，对其综合开发和利用具有重要的意义。因此本研究旨在探索 FDE对流感病毒生命过程的影响以及对流感病毒感染引起的炎症反应的作用。1材料与方法1.1 试剂与材料小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；磷酸奥司他韦（Oseltamivir）（安耐吉化学，批号：CK030008）;D M EM 高糖培养基（美国纽约Gibco公司，批号：8 12 2 554）；胎牛血清（FBS）（美国纽约Gib-co公司，批号：2 17 6 40 4）；胰蛋白酶（中国Solarbio公司,批号：510 T0419）
11、；M T T（中国Solarbio公司，批号：530 R0515）；D A PI染料（中国Beyotime公司，批号：0 7 312 0 2 0 10 2 3）；神经氨酸酶测定试剂盒（中国Beyotime 公司，批号:0 7 142 0 2 110 12);CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒（美国Promega公司,批号：0 0 0 0 42 47 2 1）；放射免疫沉淀测定（RI-PA）裂解液（中国Beyotime公司，批号：2 2 30 8 515）；小鼠抗核蛋白（NP）单克隆抗体（英国Abcam公司，批号：GR3397701-3）；山羊抗小鼠IgG结合FITC荧光二抗（中
12、杉金桥生物技术公司，批号：133449）；化合物FDE由本课题组通过各种色谱方法从蜘蛛香和赤芍中分离得到,并通过NMR和MS等波谱方法进行结构鉴定9,10 1.2仪器多功能读板仪SpectraMaxM2（美国MolecularDevices）；光学倒置显微镜CKX41（德国O-lympus）；CO,细胞培养箱3111（美国Thermofisher）;高速冷冻离心机1-14K（德国Sigma）；尼康激光共聚焦显微镜A1R/A1（日本Nikon)。1.3丝细胞毒性实验使用MTT法测FDE的细胞毒性。将FDE倍比稀释成5个浓度（6.2 5、12.5、2 5、50 和10 0 mol/L）,分别加人到
13、已长成单层细胞的9 6 孔培养板中，设正常细胞对照组，每组设置3个复孔，于37、5%CO，培养箱中培养48 h,采用MTT法测定细胞周艳等：Ferulaldehyde的体外抗流感作用研究噬斑实验MDCK细胞以310 个/孔的数量接种于12孔板中，培养2 4 h，直至长成单层细胞。用WSN（2 50 T CI D s o）感染2 h,用预冷的PBS清洗两遍，洗去未与细胞结合的病毒,加人含有不同浓度药物的无血清培养基，待其完全凝固后，倒置放人37，5%CO2培养箱。培养7 2 h后,4%多聚甲醛固定30min,去除琼脂糖覆盖层,用0.1%结晶紫染色。1.6力加药时间点实验MDCK细胞以310 个/
14、孔接种于12 孔板中,培养2 4 h。用WSN(250 TCIDso）感染细胞,分别在0 2、0 5、0 8 和0 10 h（采用预防给药的方式，WSN和FDE共同作用前2 h,然后洗去WSN,加人FDE,02 h 为WSN和药物共同作用的2 h，下同)进行FDE(60 mol/L)处理。收集裂解细胞,分析NP含量变化14,到达给药时间后,将细胞用8 0L裂解液（含1%的PI和PMSF)裂解40 min，收集裂解液,加人2 0 L的5loadingbuffer变性10 15 min后,用10%SDS-PAGE进行凝胶电泳,后将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭，一抗、二抗孵育后通过化
15、学发光显影并拍摄分析。1.7免疫荧光实验MDCK细胞以110 个/孔的数量接种于共聚焦皿中,培养2 4 h。WSN(2 50 T CI D s o）感染细胞,分别在 0 2、0 5、0 8 和 0 10 h 进行 FDE(60mol/L)处理。处理后细胞经4%多聚甲醛溶液固1365活度1,使用SpetraMaxM2检测波长为49 0 nm的吸光度。1.4体外抗流感病毒活性筛选取对数生长期的MDCK细胞以310 4个/孔接种于9 6 孔板中,待细胞的汇合率达到9 5%以上用PBS清洗细胞2 次，之后按照实验分组分别加药并于37、5%CO培养箱中培养,其中活性实验组的细胞加人不同浓度的待测样品与1
16、0 0 TCIDso病毒等比例混合后的溶液,阴性对照组细胞只加病毒,而不做任何处理的孔为对照组。待培养48 h后,用CellTiter-Glo?发光法细胞活力检测试剂盒检测其荧光值12 。病毒株A/WSN/33/2009 H1N1（WSN)的扩增方法：把病毒原液稀释后注射至培养10 11 d的鸡胚尿囊腔中,气室朝上置于35培养箱中孵育48 h。48 h 后用一次性无菌注射器缓慢吸出尿囊液,即为我们扩增的病毒，最后采用Reed-Muench法,计算细胞半数感染量TCID%。1.51366定10 min,0.1%Triton X-100打孔10 min 后，一抗孵育过夜,二抗孵育1h,DAPI 染核 10 min 后用共聚焦显微镜进行拍摄。1.8血凝素活性抑制试验根据病毒血凝滴度稀释病毒。将一系列浓度（6.2 5、12.5、2 5、50 和10 0 mol/L）的化合物与稀释后的病毒涡旋混匀后加人到V型9 6 孔板中,之后加入等体积1%的红细胞悬液，室温静置30 min，观察并记录V型9 6 孔板中红细胞的凝集效果。1.9神经氨酸酶抑制剂筛选实验通过神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测化合物对N
