1、 /轴轴调调控控结结肠肠癌癌细细胞胞对对 氟氟尿尿嘧嘧啶啶耐耐药药性性的的机机制制研研究究裴正浩 王耿泽 景小松 作作者者单单位位:河河南南省省南南阳阳市市中中心心医医院院 【摘要】目的 探讨结肠癌细胞对 氟尿嘧啶()的抵抗及潜在机制 方法使用 筛选出 和 抗性细胞系(/和/细胞)通过高通量测序和 功能筛选鉴定 处理后/细胞中影响细胞凋亡水平的关键基因 过表达该基因()后检测/和/细胞的凋亡水平和细胞活力水平 过表达或敲低此()后检测、/和/细胞的细胞活力、细胞凋亡水平和 的表达水平 例结肠癌患者按照化疗效果分为对化疗敏感型结肠癌患者()与化疗抵抗型结肠癌患者()并采用免疫组织化学染色方法检测
2、 在患者中的表达水平 结果当敲低 时/细胞的凋亡水平下降(.)处理/细胞和/细胞后 的 水平均下调(.)敲低 后并用 处理 和 显示出对 抑制增殖的抵抗(.)过表达 后/和/细胞的凋亡水平上升(.)处理后/和/细胞中 的表达水平上升(.)处理后并过表达 后 和 细胞的凋亡水平下降(.)在/细胞中过表达 后 的表达水平下降敲低 后 的表达水平上升(.)在/细胞中过表达 后 的表达水平下降敲低 后 的表达水平上升(.)免疫组织化学分析发现对化疗敏感的结肠癌患者癌组织中 表达水平较高(.)结论当结肠癌细胞 和 遇到 后细胞中 的表达水平上升 靶向 的 端非编码区并降解了 减少了 的蛋白表达最终提升了
3、结肠癌细胞 和 对 的抗性 【关键词】结肠癌氟尿嘧啶抗性 :./.中图分类号:.文献标识码:文章编号:()/.【】().(/)./././()./(.)./(.).(.)./(.)./(.).(.)./.(.)./.实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .(.).(汇合时进行胰酶消化传代并增加 的剂量 根据制造商的说明 将 细胞接种在 孔板中 以达到 的汇合度并使用 或对照 使用 瞬时转染细胞.抽取与实时定量 根据制造商的方案使用 提取总 总 用于使用 逆转录酶生成 聚合酶链反应()使用 以 的最终反应体积进行 次重复使用基因特异性引物/探针组和标准热循环程序(个循环)在 实时 系统上 使用 基因
4、表达实时 测定法评估相对基因 水平 结果表示为阈值循环()根据制造商的协议通过比较 方法()确定目标转录物的相对定量 法用于分析基因表达的相对变化 在没有逆转录的情况下进行对照实验以确认总 没有被基因组 污染 表达作为 的内参 作为 的内部对照.免疫印迹使用针对 和 的抗体进行蛋白质印迹分析.细胞增殖水平的检测 后细胞以 个细胞/孔的密度在 孔板中培养 然后用浓度增加的 处理细胞 随后根据制造商的说明使用 检测试剂盒进行细胞增殖水平的检测使用 测量发光实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .每个测定一式 份进行并重复 次.荧光素酶报告实验为了评估 的功能将 的 扩增并插入荧光素酶报告基因载体 中
5、使用 作为模板扩增 并使用定点诱变试剂盒构建突变质粒 对于荧光素酶报告基因检测将细胞与 和 或 以及作为内部对照的海肾荧光素酶 载体共转染 转染 后收集细胞并使用 缓冲液裂解 然后根据制造商的说明使用双荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性.细胞凋亡的检测使用膜联蛋白 和 进行膜联蛋白/碘化丙啶染色显微镜观察凋亡情况.免疫组织化学纳入治疗的结肠癌患者 例其中男性 例女性 例平均年龄(.)岁 收集患者的实体肿瘤标本按照化疗效果分为对化疗敏感型结肠癌患者()与化疗抵抗型结肠癌患者()所有患者均知情同意并且签署知情同意书 本研究由我院的伦理委员会批准:伦理批号“”应用即用型免疫组化试剂盒对两类患者的肿瘤样
6、本进行 的免疫组织化学分析根据染色程度从浅到深分成 个等级:级、级、级和 级其中 级和 级定义为 低表达、级和 级定义为 低表达本研究所有展示的图为典型图.统计学分析所有数据均表示为至少一式三份样品的平均值 标准偏差 统计分析包括使用 软件的单向方差分析或学生 检验 卡方检验分析 表达高低与结直肠癌患者化疗敏感的相关性 .被认为具有统计学意义 结结果果.抗性的 和 细胞的构建 处理可以显著抑制亲本细胞的增殖和诱导细胞凋亡(.)但不能抑制抗性细胞见图、图 和图 此外在 处理后/和/中细胞周期阶段的分布发生了显著变化 处理可在 和 细胞中显著诱导 期停滞(.)但在/和/中则不然见图 和图 这些数据
7、表明 抗性细胞(/和/)已成功筛选出图 抗性的 和 细胞的构建.对 抗性的 和 细胞的影响 将 处理和未处理的/细胞进行高通量测序发现 处理后多个基因的表达水平被调节见图 通过 筛选发现当敲低 时/细胞的凋亡水平下降(.)见图 使用 处理/细胞和/细胞后发现 的 水平均下调(.)见图 和图 在 和 实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .细胞中敲低 后并用 处理发现 和 显示出对 抑制增殖的抵抗(.)见图 和图 过表达 后发现/和/细胞的凋亡水平上升(.)见图 和图 敲低 后发现/和/细胞的凋亡水平下降(.)见图 和图 图 对 抗性的 和 细胞的影响.靶向 促进 和 细胞对 的抵抗 通过 在线分析
8、发现有多个 靶向 处理后发现/细胞中 的表达水平上升(.)见图 处理后发现/细胞中 的表达水平上升(.)见图 处理后并过表达 后 的凋亡水平下降(.)处理后并敲低 后 的凋亡水平上升(.)见图 处理后并过表达 后 的凋亡水平下降(.)处理后并敲低 后 的凋亡水平上升(.)见图 在/细胞中过表达 后 的表达水平下降敲低 后 的表达水平上升(.)见图 在/细胞中过表达 后 的表达水平下降敲低 后 的表达水平上升(.)见图、图 和图 同时 靶向 的 端非编码区见实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .图 此外通过免疫组织化学分析发现对化疗敏感的结肠癌患者癌组织中 表达水平较高(.)见图 图 靶向 促进
9、和 细胞对 的抵抗 讨讨论论 结直肠癌是结直肠上皮细胞的癌症已被确定为全球第三大最常见的癌症类型 它是由多种因素共同引起的包括饮食、基因突变以及生殖或外源激素的使用 为防止病情进一步恶化目前不同阶段的结直肠癌治疗药物主要是 等常规化疗药物然而结直肠癌易对 产生耐药性 在本研究中敲低 时/细胞的凋亡水平下降(.)使用 处理/细胞和/细胞后 的 水平均下调(.)在 和 细胞中敲低 后并用 处理 和 显示出对 抑实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .制增殖的抵抗(.)过表达 后/和/细胞的凋亡水平上升(.)敲低 后/和/细胞的凋亡水平下降(.)代谢的基本酶是胸苷酸合成酶它属于 合成代谢 个途径中最重要
10、的一个像其他参与 合成或分解代谢的酶一样它们经常被改变促进 抗性 此外 还可改变 细胞的主要细胞功能(凋亡、自噬、呼吸、糖代谢和细胞周期)这些细胞功能的改变构成了关键的 抗性机制 网状蛋白()已被鉴定为内质网整合膜蛋白涉及多种凋亡信号通路 该家族包括四个旁系同源物称为、和 先前的研究表明 的过表达可能会通过 的异位过表达来诱导正常 细胞的细胞凋亡 在 人胚胎肾细胞系中高度表达并观察到其可通过 端激酶 信号通路诱导细胞凋亡 此外 通过诱导细胞凋亡抑制肝细胞癌细胞的生长 因此 是促进肿瘤细胞凋亡的关键分子并且 通过参与细胞凋亡来影响肿瘤细胞对 的抵抗本研究中使用 处理/细胞和/细胞后发现 的 水平
11、均下调(.)提示 在转录后水平受到调控 是内源性 个核苷酸的单链非编码 通过不完全互补匹配与 的目标 结合从而通过翻译抑制或 切割来降低蛋白质表达 先前的报告表明 参与各种生物过程如组织稳态、器官发育、细胞增殖、细胞凋亡和人类疾病 在癌细胞中 可能通过靶向肿瘤抑制基因的方式作为肿瘤启动子发挥作用 处理后/细胞中 的表达水平上升(.)处理后/细胞中 的表达水平上升(.)处理后并过表达 后的凋亡水平下降(.)处理后并敲低 后 的凋亡水平上升(.)处理后并过表达 后 的凋亡水平下降(.)处理后并敲低 后 的凋亡水平上升(.)在/细胞中过表达 后 的表达水平下降敲低 后 的表达水平上升(.)在/细胞中
12、过表达 后 的表达水平下降敲低 后 的表达水平上升(.)同时 靶向 的 端非编码区 综上所述当结肠癌细胞 和 遇到 后细胞中 的表达水平上升 靶向 的 端非编码区并降解了 减少了 的蛋白表达最终提升了结肠癌细胞 和 对 的抗性参考文献 .():.()():.():.():./.():.许迪米曰堂.结直肠癌与 细胞亚群的关系.中国现代普通外科进展():.():.:.():.():.():.():实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .():.:.():.():.张晓玲罗衡桂陈伟等.加速康复外科管理模式在老年结直肠癌围手术期应用效果.中国普通外科杂志():.许 剑刘斌魏周阳等.湖南省局部地区无症状结直肠腺瘤型息肉的流行病学特征分析.中国普通外科杂志():.刘 永徐建忠蒋 敏等.和 在结直肠癌中的表达及其相关性.中南医学科学杂志():.陈科全叶秀杰许研等.急诊胃镜辅助下结肠支架置入术在左半结肠癌急性肠梗阻中的应用.中华生物医学工程杂志():.?.():.():.():.():.:.():.()():.():.()/.():./.():.孙萍萍柳雪李丹等.高通量测序确定肠道病毒 型感染致宿主细胞 表达谱的改变.中华实验和临床病毒学杂志():.():.():.(收稿日期 修回日期 )(编辑:吴小红)实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .
