1、第34卷第3期2023年9月广 西 科 技 大 学 学 报JOURNAL OF GUANGXI UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGYVol.34No.3Sept.2023UPLC-MS/MS法同时测定发酵面制品中7种甜味剂蒋叶灵1，侯绪和*2，吕保樱2（1.桂林市食品药品检验所，广西桂林541200；2.广西科技大学医学部，广西柳州545005）摘要：应用超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）实现发酵面制品的
2、7种甜味剂（糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、三氯蔗糖）同时检测。样品经机械震荡、超声萃取，亚铁氰化钾溶液和乙酸锌沉淀蛋白，经0.22 m滤膜过滤预处理，以Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm50.0 mm，1.8 m）和乙腈-水为流动相梯度洗脱；电喷雾负离子模式（ESI-）下采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行分段采集。实验结果：7种甜味剂在0.010.50 g/mL浓度范围内线性关系较好，相关系数r2均大于0.999 1，检出限为3.010-63.010-4g/kg，定量限为1.010-51.
3、010-3g/kg，样品平均加标回收率为84.5%96.5%，相对标准偏差为1.3%8.1%（n=6）。实验结果表明：该方法快速、准确、重现性好，在各种发酵面制品检测中有广泛的应用前景。关键词：甜味剂；发酵面制品；超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）中图分类号：TS213.2DOI：10.16375/45-1395/t.2023.03.0180引言发酵面制品是指以面粉为主要成分，经由和面-发酵-熟制而成的一类食品，包括馒头、包子、花卷、蒸糕等，是我国北方居民的主要粮食，占其主食的70%以上1，其中馒头是60%以上消费者的主食2。可见发酵面制品在人们的生活中占据着重要的地位。甜味剂
4、能够增加食品的甜度，增强食品的口感3。目前，我国使用的甜味剂主要有安赛蜜、三氯蔗糖、甜蜜素、糖精钠、纽甜等化学合成甜味剂。化学合成甜味剂的长期大量摄入可能会引起肠道菌群结构和组成改变，使用量过大可导致血糖高、葡萄糖不耐受等代谢系统疾病，甚至会导致脾气暴躁、性格压抑、记忆力衰退、阿尔兹海默症等神经系统异常及致癌4-7。在 食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB 27602014）8中规定发酵面制品中均不得使用上述化学合成甜味剂，然而部分商家为了追求经济效益，存在滥用、违规使用等不规范行为。常用的化学合成甜味剂检测方法主要有气相色谱法9-10、离子色谱法11、高效液相色谱法12-14、高效液相色
5、谱-串联质谱法（ultra-high performance liquidchromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS）15-16等。使用气相色谱法进行检测需要进行衍生化处理后方能使用，操作繁琐，在食品检验中适用度不高17-18。离子色谱法检测合成甜味剂时对样品基质要求纯净，而食品基质复杂性高，离子色谱法适用度较差。高效液相色谱法是合成甜味剂检测中最为常用的检测方法19，同时高效液相色谱法也是 食品安全国家标准食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定（GB 5009.2632016）20和食品中糖精钠的测定（GB/T 5009.282003）21规定使用
6、的测定方法。但由于发酵面制品中存在泡打粉等影响因素，存在基质干扰引起的假阳性现象22，并且在现行标准中也未有将7种合成甜味剂在高效液相色谱法中同时检测的方法。因此，开发发酵面制品中合成甜味剂同时检测的新方法是目前亟待解决的问题。本研究基于超高效液相色谱-串联质谱法，建立了同时检测发酵面制品的7种甜味剂（糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜、收稿日期：2023-02-03基金项目：广西科技基地和人才专项（桂科AD19110002）资助第一作者：蒋叶灵，本科，工程师，研究方向：食品安全与检测*通信作者：侯绪和，博士，助理研究员，研究方向：化学分析，E-mail：第3期蒋叶灵等：UPLC-MS/
7、MS法同时测定发酵面制品中7种甜味剂纽甜、三氯蔗糖）的方法。该方法利用了超高效液相色谱柱效高的特点，分离度高，分析速度快，色谱峰更尖锐使得信噪比增大，从而提高分析灵敏度，解决了复杂基质的多组分同时测定的问题。由于UPLC-MS/MS选择性高、灵敏度好，因此在食品监督检测中有广泛的应用前景，并可提高监管效率，为市场上此类食品的安全检测提供参考，具有一定的社会效益。1材料与方法1.1材料、仪器与试剂样品：马拉糕、馒头、花卷、包子共50批，均购于本地超市和商店。仪器：超高压三重四极杆液质联用仪（型号：Agilent 1290-646，安捷伦科技有限公司）；电子天平（型号：XS205DU，梅特勒-托利
8、多仪器（上海）有限公司）；Multi Reax涡旋振荡器（德国海道夫集团）；超声波清洗器（型号：DTA-42，鼎泰（湖北）生化科技设备制造有限公司）；冷冻离心机（型号：ROTANTA460R，德国Hettich有限公司）；SYNS00000密理博超纯水机（美国Millipore公司）。试剂：甲醇、乙腈（色谱纯），均为默克股份有限公司；甲酸（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯），均为Fisher Scientific；亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯），均为西陇科学股份有限公司；微孔滤膜，0.22 m，天津市科亿隆实验设备有限公司。对照品：糖精钠（1 mg/mL，中国计量科学研究院，批号：GBW（E）
9、100008-19001）；安赛蜜（质量分数：100%，StanfordChemicals，批号：ASF-785053-AP171106-18）；甜蜜素（质量分数：99.12%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号：G140210）；阿斯巴甜（质量分数：99.50%，Stanford Chemicals，批号：ASP-841481-AL171106-06）；阿力甜（1 000 g/mL，TMstandard，批 号：3452006）；纽 甜（质 量 分 数：99.14%，Stanford Chemicals，批号：NT-230025）；三氯蔗糖（质量分数：98.41%，Stanfor
10、d Chemicals，批号：24714XA-14658-036）。1.2实验方法1.2.1质谱条件离子源：电喷雾离子源，负离子模式（ESI-）；离子源温度：350；雾化气流速：5 L/min；鞘气温度：350；鞘气流速：11 L/min；雾化器电压：45psi；毛细管电压：-3 000V；扫描模式：多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。1.2.2色谱条件液 相 色 谱 柱：Agilent Eclipse Plus C18 柱（2.1 mm50.0 mm，1.8 m）；进样体积：5 L；流速：0.3 mL/min；柱温：35；流动相：A-乙腈、B
11、-纯水，流动相梯度洗脱条件见表1。表1流动相梯度洗脱条件时间/min015流动相A/%5590流动相B/%9595101.2.3对照品储备液的制备精密称取阿斯巴甜、纽甜、安赛蜜、三氯蔗糖、甜蜜素适量，分别用纯水（纽甜用0.1%甲酸水）配制成 1.078 6、1.037 0、1.228 0、1.089 4、0.893 1 mg/mL的单标储备液；精密移取糖精钠标准溶液2 mL，配制成0.760 mg/mL的储备液；阿力甜储备液（质量浓度1 000 g/mL）；于4 冰箱中保存。1.2.4混合标准中间液的配制精密吸取1.2.3对照品储备液中安赛蜜0.4 mL、糖精钠2 mL、甜蜜素0.2 mL、阿
12、斯巴甜4 mL、三氯蔗糖 4 mL、纽甜 0.2 mL，阿力甜对照品原液0.04 mL定容至20 mL容量瓶中备用。1.2.5混合标准使用液的配制精密移取上述1.2.4混合标准中间液适量，加入空白基质定容至刻度，摇匀。制得混合标准使用液，含阿斯巴甜：10.786 0 mg/L，纽甜：0.518 5 mg/L，安赛蜜：1.228 0 mg/L，三氯蔗糖：10.894 0 mg/L，甜蜜素：0.446 6 mg/L，糖精钠：3.800 0 mg/L，阿力甜：0.100 0 mg/L。1.2.6样品处理发酵面制品实际样品处理测试：分别称取4份阴性样品各5 g，各精密加入1.2.4中混合标准中间液0.
13、25 mL，分别加入纯水、20%甲醇-水、50%甲醇-水、70%甲醇-水25 mL，分别加入106 g/L亚铁氰化钾溶液和220 g/L乙酸锌溶液2.5 mL，涡旋10 min后定容至50 mL，超声15 min，经7 000 r/min 离心10 min，过0.22 m微孔滤膜后，待测。阴性样品处理：取2份阴性样品同法处理，得空白基质。1.2.7加标回收检测称取5 g不同种类发酵面制品阴性样品（代表不同基质基底），分别精密加入混合标准储备液（阿斯巴甜：10.786 0 mg/L，纽甜：0.518 5 mg/L，安赛133第34卷广 西 科 技 大 学 学 报蜜：1.228 0 mg/L，三氯
14、蔗糖：10.894 0 mg/L，甜蜜素：0.446 6 mg/L，糖精钠：3.800 0 mg/L，阿力甜：0.100 0 mg/L）0.125 mL（低浓度水平）、0.250 mL（中浓度水平）、1.000 mL（高浓度水平），按1.2.6方法进行前处理，按上述优化好的色谱条件操作，对低、中、高3个浓度梯度水平的样品进行6次平行测定。2结果与讨论2.1质谱条件的优化分别使用5 mg/L各组分标准溶液依次采用直接进样的方式逐一进行测试，在ESI正离子和ESI负离子模式下分别进行MS2扫描，选择了响应力较强的激基缔合体的母离子，而糖精钠和安赛蜜在ESI正离子状态下无法寻找适当的母离子，所以首先
15、使用ESI负离子方法进行测量。Product Ion 模式中选择各组分的最佳子离子和碎裂电压，在MRM模式中选定各组分子离子的碰撞能量。7种甜味剂的质谱MRM参数见表2。表27种甜味剂的质谱MRM参数化合物糖精钠安赛蜜甜蜜素阿斯巴甜阿力甜纽甜三氯蔗糖母离子质荷比182.0162.0178.0292.9330.2377.2395.0子离子质荷比105.742.2*81.8*77.9178.1*80.0260.9*199.8312.0*295.0300.9200.0*359.0碎裂电压/V1409075120130165120130120140155140碰撞能/eV182512351030410
16、81513124注：*为定量离子。2.2色谱条件的优化2.2.1色谱柱的选择本研究分别考察了 Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm50.0 mm，1.8 m）、Agilent Poroshell 120SB-C8（2.1 mm100.0 mm，2.7 m）、Agilent SB-C18（2.1 mm50.0 mm，1.8 m）3种色谱柱，其高效液相色谱图见图1。通过图1可知，3种色谱柱中，Agilent Poroshell 120 SB-C8峰形有拖尾现象，保留时间为4.6 min，纽甜的峰不尖锐；Agilent SB-C18保留时间为3.4 min，峰有重叠，分离效果差；Agilent Eclipse Plus C18（简称C18）柱峰宽较窄，峰形尖锐，柱效高，分离效果最好。因为C18为全硅胶基键合18个碳的烷烃色谱柱，Agilent Poroshell 120SB-C8 为全硅胶基键合 8 个碳的烷烃色谱柱，而Agilent SB-C18具有较大的二异丁基（SB-C18）侧链基团，更适用于低pH值的体系。C18柱适合分离弱极性、中极性相对较弱的化合物，7种
