1、D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 1 0 2第4 2卷第4期2 0 2 3年7月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.4J u l.2 0 2 3草鱼脂肪组织及脂肪细胞q R T-P C R内参基因的筛选胡泽超,邹孝翠,孙 健,边晨晨,吉 红(西北农林科技大学 动物科技学院,陕西 杨凌7 1 2 1 0 0)摘 要:为探究4个内参基因在草鱼脂肪组织和脂肪细胞中的稳定表达情况及筛选稳定性最佳的内参基因,采用实时荧光定量P C R(q R T-P C R)技术检测了在水温2 6
2、.52 7.5下,摄食脂肪含量为4%、8%和1 2%的饲料4周、体质量为(1 5.00.5)g的草鱼腹腔脂肪组织中及在成脂培养基中诱导分化至第6天时,用含0、4 0、8 0、1 2 0mm o l/L的油酸处理的草鱼脂肪细胞中的1 8 Sr R NA基因、-a c t i n基因、G A P DH基因和E F 1 基因等4个候选内参基因的转录水平,随后采用G e N o r m、N o r m F i n d e r和B e s t-k e e p e r软件分析其表达稳定性,以筛选出特定条件下草鱼脂肪组织及脂肪细胞中稳定表达的内参基因或其组合。结果显示,候选内参基因的定量P C R引物均可获
3、得特异性扩增产物和理想的扩增效率。在草鱼脂肪组织和脂肪细胞中,候选内参基因表达稳定性顺序分别为1 8 Sr R NA-a c t i nG A P DHE F 1 和1 8 Sr R NA=-a c t i nG A P DHE F 1。G e N o r m标准化因子配对差异分析显示,其配对变异值均小于0.1 5,即草鱼脂肪组织及脂肪细胞中最适内参基因数至少有2个。结果表明,在草鱼脂肪组织和脂肪细胞中稳定表达的是1 8 Sr R NA基因,建议选择1 8 Sr R NA、-a c t i n基因作为草鱼脂肪组织及脂肪细胞内参基因组合。关键词:实时荧光定量P C R;草鱼;内参基因筛选;脂肪组
4、织;脂肪细胞;表达稳定性中图分类号:Q 7 8文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 5 4 7-0 9收稿日期:2 0 2 1-0 6-1 5;修回日期:2 0 2 1-1 2-0 1.基金项目:国家自然科学基金面上项目(3 1 7 7 2 8 6 3).作者简介:胡泽超(1 9 9 8),男,硕士研究生;研究方向:水产动物营养与饲料科学.E-m a i l:1 5 1 5 4 6 2 3 5 3q q.c o m.通信作者:吉红(1 9 6 7),男,教授,博士生导师;研究方向:水产经济动物营养学、水产增养殖学.E-m a i l:j i h o
5、 n g n w s u a f.e d u.c n.实时荧光定量P C R(q R T-P C R)技术已成为分子生物学领域 开展基因定 量表达分析 的重要手段1-2。然而,R NA质量、基因扩增效率等因素均会影响q R T-P C R结果的准确性3-4。因此,通常需要引入合适的内参基因对试验数据进行标准化和校正,以减少试验误差。理想情况下,内参基因应在任何条件下均具有恒定的表达水平。试验常用的内参基因有1 8 S核糖体R NA(1 8 Sr R NA)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GA P DH)基因、延伸因子1(E F 1)基因、-肌动蛋白(-a c t i n)基因等。研究发现,一些内参
6、基因表现出不同程度的表达稳定差异性5-6。金属铬胁迫下的草鱼(C t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a)肝胰脏组织1 8 Sr R NA、GA P DH、-a c t i n、微球蛋白(2m)内参基因的 稳定性研究 表明,-a c t i n基因的表达水平与其他基因有显著差异7。这与嗜水气单胞菌(A e r o m o n a s eh y d r o p h i l a)感染的肝 脏 和 头 肾 组 织1 8 Sr R N A、G A P D H、-a c t i n、E F 1 基因稳定性研究结果类似,-a c t i n基因的表达极不稳定8。草
7、鱼呼肠孤病毒感染后的草鱼脾组织1 8 Sr R N A、G A P D H、-a c t i n、E F 1 基因稳定性研究显示,E F 1 基因表达稳定性很差9。以1 8 Sr R NA基因作为内参基因,会对草鱼肌球蛋白重链基因的表达检测结果造成偏差1 0。因此,需要筛选出特定条件下稳定表达的内参基因或其组合,以保证q R T-P C R结果的准确性。而对营养干预条件下草鱼内参基因表达稳定性的研究尚未见报道。笔者以不同脂肪水平日粮所饲养草鱼的腹腔脂肪组织及不同浓度油酸处理的草鱼脂肪细胞为试验材 料,利 用q R T-P C R技 术 并 结 合G e N o r m1 1、N o r m F
8、 i n d e r1 2、B e s t K e e p e r1 3软件对-a c t i n、E F 1、GA P DH、1 8 Sr R NA内参基因的表达稳定性进行评估,以筛选出稳定表达的内参基因或其组合,从而为今后在脂肪营养干预条件下的草鱼脂肪组织及脂肪细胞中基因表达分析研究提供理论基础和参考依据。1 材料与方法1.1 试验动物及饲养管理试验草鱼购自广州金沙水产养殖场;选取9 0尾体质量为(1 5.00.5)g的草鱼,随机分配,共3个试验组,每组设3个平行,每个平行1 0尾。试验开始前用4%脂肪含量的草鱼日粮饲喂暂养1周,使其适应新环境和饲料;暂养1周后,3个组随机分配用脂肪质量分
9、数为4%、8%、1 2%的草鱼日粮饲喂,并将其饲养在室内9个1.0m0.5m0.6m的鱼缸中;按鱼体质量的1%3%饲喂,每日8:0 0、1 2:0 0、1 8:0 0投喂,养殖期间充气泵2 4h充氧,保证充足溶解氧,开关室内日光灯模拟室外昼夜交替,每隔3d更新1/31/2水体,饲养4周。试验期间养殖水温2 6.52 7.5,p H7.58.5,溶解氧质量浓度5.0m g/L。1.2 样品采集饲养试验结束后,禁食2 4h,再用麻醉剂间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉草鱼,采集草鱼的腹腔脂肪组织,液氮处理后-8 0储存备用。1.3 脂肪细胞培养及油酸处理自杨凌康乐市场购得体质量约1k g健康无病草鱼6尾
10、。麻醉后剪断鳃弓放血,用洗洁精清洗鱼体3遍至洁净后待用。草鱼前体脂肪细胞分离和培养参考实验室建立的培养体系1 4:分离出腹腔脂肪组织,用磷酸盐缓冲液(P B S,p H7.4)对组织进行4次洗涤,在0.1%I型胶原酶(S i g m a,美国)与2%B S A(S i g m a,美国)中于室温下剪碎3 0m i n。细胞悬浮液通过2 0 0m尼龙过滤器过滤,于2 3 0 5r/m i n(离心半径1 0c m)下离心1 0m i n。离心后沉淀的细 胞 颗 粒 在 红 细 胞 裂 解 缓 冲 液 中 室 温 孵 育6m i n,然后洗涤2次,再悬浮于由DMEM/F 1 2培养基、1 0%F
11、B S、1 0 0U/m L青霉素和1 0 0U/m L链霉素组成的生长培养基(GM)中。以1 0g/2 5c m2的密度接种在明胶预处理的2 4孔板中。生长7d后,用添加1 0g/m L胰岛素、1 0n m o l/L三碘甲状腺原氨酸、1m o l/L地塞米松和0.5mm o l/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(I BMX)的含GM的成脂培养基中诱导分化。培养基每2d更换1次。在分化第6天,用浓度0、4 0、8 0、1 2 0mm o l/L的油酸生长培养基孵育细胞,2 4h后收集细胞,于-8 0 条件下储存备 用。对照组和 处理组各设 置4个平行。1.4 总R NA提取及c D NA合成依照
12、R N e a s yP l u sM i n iK i t试剂盒(Q I A G E N,德国)说明书进行草鱼脂肪组织和脂肪细胞的总R NA提取。总R NA质量检测采用质量体积1.5%琼脂糖凝胶电泳法,R NA浓度和纯度则使用N a n o-D r o pTML i t e(T h e r m oS c i e n t i f i c,美国)核酸浓度测定仪 检 测。遵 循P r i m e S c r i p tR T r e a g e n t K i tW i t hg D NAE r a s e r(T a K a R a,日本)逆转录试剂盒说明书的指导将提取的R NA合成单链c D
13、NA,再用6 0L的灭菌水稀释混匀,于-2 0 保存,用于q R T-P C R分析。1.5 引物设计及合成-a c t i n、E F-1、GA P DH、1 8 Sr R NA4个候选内参基因的引物由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列9见表1。表1 候选内参基因的引物序列 T a b.1 P r i m e r s e q u e n c e s f o r t h ec a n d i d a t e r e f e r e n c eg e n e s内参基因R e f e r e n c eg e n e引物P r i m e r引物序列(5 3)P r i m e r s e
14、q u e n c e产物长度/b pP r o d u c t s i z e登录号A c c e s s i o nN o.扩增效率/%E f f i c i e n c y相关系数r2C o e f f i c i e n t1 8 Sr R NA1 8 Sr RNA-FAT T T C C GA C A C G GA GA G G1 8 Sr R NA-RC A T G G G T T T A G GA T A C G C T C9 0E U 0 4 7 7 1 99 7.0 20.9 9 9 6-a c t i n-a c t i n FC G T GA C A T C AAG GA
15、 GAA G-a c t i n RGA G T T GAA G G T G G T C T C A T1 2 9M 2 5 0 1 39 8.7 70.9 9 9 3GA P DHGA P DH-FG T T A C AA G G GA GAA G T T C A C C A TGA P DH-RC C G G T A GA C T C GA C TA C A T A C A G1 3 6GQ 2 6 6 3 9 59 5.6 60.9 9 6 9E F 1 E F 1 -FC G C C A G T G T T G C C T T C G TE F 1 -RC G C T C AA T C
16、 T T C C A T C C C T T9 9GQ 2 6 6 3 9 41 0 2.8 40.9 9 6 01.6 内参基因扩增效率检验将所合成 的 脂 肪 组 织 和 细 胞c D NA进 行 每份1 0L等量 混合,制成2种c D NA混合 液,按照5倍比例稀释6个梯度(1、1/5、1/2 5、1/1 2 5、1/6 2 5、1/3 1 2 5),以 其 为 模 板 进 行q R T-P C R分析;每个稀释梯度的起始模板浓度与循环阈值间呈线性关系,根据循环阈值进行自然对数作图做线性回归分析,得出相关系数r2和回归直线斜率k,再根 据E=(1 0-1/k-1)1 0 0%计 算 扩 增 效率E。845水 产 科 学第4 2卷1.7 q R T-P C R分析以所制备的c D N A为模板,采用所合成的引物,对包含上、下游引物各0.6L(0.5m o l/L),1.0Lc D N A,1 0LC h a mQTMS Y B Rq P C R M a s t e rM i x(诺唯赞生物科技有限公司,中国)和7.8L灭菌双蒸水的2 0L扩增体系利用C F X 9 6 TM实时P
