1、【医药与卫生】:./.白藜芦醇对镧神经损伤仔鼠脑内 表达的影响丁梦平 周燕 张雪 靳宁梅 刘宝璐 李囡(辽东学院 医学院 辽宁 丹东)摘 要:为探讨白藜芦醇对镧神经损伤仔鼠的作用及其对脑内低氧诱导因子 ()表达的影响 建立仔鼠 /水溶液镧暴露模型 建模后把仔鼠随机分为对照组、阳性对照组和低、中、高剂量白藜芦醇干预组 分别以蒸馏水或不同剂量的白藜芦醇灌胃 并在次日检测各组仔鼠学习及记忆能力 白藜芦醇干预前后称量仔鼠体质量、全脑质量、海马质量 计算全脑系数、海马系数并测定海马组织 和蛋白含量 结果显示:染镧仔鼠的体质量下降、脑发育受损 白藜芦醇干预后染镧仔鼠的体质量、全脑质量、海马质量及其组织系数
2、均逐渐上升 随着白藜芦醇干预剂量的增加 定向航行实验中仔鼠的游泳距离和平均逃避潜伏期逐渐缩短(.)空间探索实验中仔鼠游泳距离及停留在目标象限的时间、穿越目标象限和隐蔽站台的次数均逐渐增加(.)海马组织中 表达水平明显上升(.)蛋白的含量明显增加(.)因此 镧可在仔鼠脑组织蓄积并造成其学习、记忆能力下降 白藜芦醇可减轻镧暴露所致神经损伤 其机制可能与海马组织中 基因含量的增加有关关键词:镧 白藜芦醇 低氧诱导因子 学习记忆中图分类号:文献标志码:文章编号:()中国稀土资源丰富占全球总量的.稀土元素()可通过消化道、呼吸道等多种途径进入并蓄积在人体脏器中影响其正常功能 镧()是一种被广泛使用的 自
3、然界含量较多 化学性质活泼经常作为研究 效应的代表 有研究表明 镧可在脑内蓄积 破坏神经系统使其功能障碍仔鼠在孕哺期及断乳后连续摄入氧化镧 个月可使海马神经元受损 导致学习、记忆能力下降白藜芦醇()是一种天然的多酚类化合物 具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等多种药理学活性 研究表明 白藜芦醇可促进大鼠脑缺血再灌注损伤神经元的修复、保护神经组织完整性从而改善大鼠认知功能障碍 还可提高脑组织内源性抗氧化酶活力、抑制自由基的产生 从而提高机体抗氧化能力和改善免疫力 低氧诱导因子()是一种氧敏感性转录因子 在适应低氧环境过程中发挥着关键作用 已有研究表明 可在缺氧状态下诱导多种靶基因的表达 通过促进血管生
4、成、增强细胞糖酵解能力等途径发挥作用 还可以通过激活/、/及 激酶/等多种脑保护信号通路改善缺血再灌注后的脑组织 逆转神经元细胞凋亡 张雯等研究表明 右美托咪定干预后 表达上调可激活机体内源性抗氧化通路 改善线粒体功能 从而降低氧化应激反应 减少脑梗死范围目前关于 对镧暴露所致海马神经细胞损伤的保护作用及其分子机制的相关性研究尚未见报道 本研究拟在白藜芦醇干预动物模型中探讨 在白藜芦醇改善镧神经损伤过程中的作用及机制第 卷第 期 辽东学院学报(自然科学版).年 月 ().收稿日期:基金项目:辽东学院大学生创新创业项目()作者简介:丁梦平()女 安徽蚌埠人 研究方向:环境污染物的神经毒理通信作者
5、:李囡()女 辽宁丹东人 硕士 副教授 研究方向:环境污染物的神经毒理 材料和方法.材料白藜芦醇(公司 美国)、试剂、反向转录系统()和 购自翊圣生物公司(中国)、蛋白定量检测试剂盒(碧云天 中国)、抗体(公司 美国)、标记山羊抗兔二抗(武汉三鹰 中国)电子天平、高速离心机(型号 中国)、荧光实时定量 (型号 美 国)、蛋 白 质 电 泳 仪(公司 中国)和电转印装置(公司 中国)、电泳凝胶成像分析系统(公司 美国).方法.动物分组与染镧选择 级健康、性成熟的 雌、雄性大鼠各 只(购于辽宁长生生物技术有限公司中国)龄 体质量为()雌雄大鼠各随机分成对照组(饮用蒸馏水)只、染镧组(根据前期实验确
6、定的染毒质量浓度为 /的蒸馏水溶液)只 雌、雄大鼠按 的方式同笼配对 次日晨于雌鼠阴道检查出精子 记为妊娠第 其间保持饲养环境温湿度适宜 及时更换垫料染镧组孕鼠通过自由饮水进行染镧 同组仔鼠在断乳前经母体血循环及吸吮母乳染镧 断乳后通过日常自由饮水染镧 至仔鼠出生后 结束随后将染镧组仔鼠随机均分为阳性对照组和低、中、高剂量 干预组 对照组和阳性对照组统一用蒸馏水./灌胃 低、中和高剂量 干预组分别用、和 /()白藜芦醇灌胃 共计 结束 不同浓度白藜芦醇用二甲基亚砜()与蒸馏水配制除对照组日常饮用蒸馏水外 其他剂量组日常持续饮用 /的蒸馏水溶液直至 结束.仔鼠发育情况测定自仔鼠出生后每周称取体质
7、量并记录 灌胃 完成后 随机从每组抽取 只仔鼠 经麻醉后立即断头 置于冰袋上分离脑组织并剥离出海马 用生理盐水清洗后吸干表面水分并称重记录 随即置于液氮冷冻 左右后放置于 的冰箱中备用 计算脑组织系数、海马组织系数(脑组织系数 脑组织质量/体质量、海马组织系数 海马组织质量/体质量).水迷宫实验灌胃给药 后 将各组仔鼠进行连续 的学习记忆训练以及间隔 的空间探索实验 整个实验均在水温为()的圆形水缸内进行(直径为 高为 水深为 )水里加入可食用黑色素呈不透明状态 周围挂有深蓝色幕布 水迷宫的摄像系统固定在其上方离地面.的支架中央上 将圆形水缸划分为 个象限 在水缸的第 象限的固定位置水面下.放
8、置 个直径 的隐藏圆形站台 仔鼠分别在 个象限的中点入水训练如果仔鼠在 内找到站台可允许其在站台上停留约 否则引导其到达站台并在站台上停留 连续训练 后间隔 再进行空间探索实验:撤除隐藏站台后各组仔鼠仅从第象限中点同一位置处入水记录其在 内在目标象限的游泳距离和停留时间、进入目标象限的次数、穿越隐藏站台的次数及游泳路径.检测 表达各剂量组随机选取海马神经细胞 按照说明书于细胞沉淀中加入 后 混匀放置 使其充分裂解 按照要求向离心管中加入 氯仿 剧烈颠倒混匀数次 、/离心 转移上层水相至新的 管中 并加入等体积的异丙醇 混匀 静置 后 、/离心 管底可见白色的 沉淀 弃上清 沉淀块用无水乙醇洗涤
9、离心后重复该操作一次 再向空气干燥 的 沉淀中加入焦碳酸二乙酯()水 待溶解后取 用微量分光光度计测定 值 计算 的纯度和浓度 之后进行 逆转录及扩增 以 为内参 利用 法分析 的相对表达量 以反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数为统计参数 取 次独立实验检测结果的平均值为最终的 值 利用公式:基因 值 基因 均数 染镧组样本 对照组样本 得出 基因相对表达水平 .检测 蛋白表达()裂解液加辽东学院学报(自然科学版)第 卷入细胞样本后于冰上裂解 冰浴超声 离心(/)后取上清液采用 法测定蛋白的浓度 根据蛋白含量加入 煮沸 凝胶电泳是用/分离胶和/浓缩胶制作的 按要求点加样品和预染
10、将电压调至 待溴酚蓝跑到分离胶时电压调为 转 膜 电转.洗膜一遍在室温下用/脱脂奶粉的 摇床封闭 再次漂洗 膜洗膜后经兔抗大鼠 一抗()、山羊抗兔二抗()孵育 室温摇床 再用 洗涤 共 次 膜的正面接触发光试剂 显色.后翻转过来 用凝胶成像系统采集图像 分析 蛋白条带积分灰度值 用半定量法分析海马 蛋白的表达水平 其中 以 作为内参来校正.统计学分析数据采用 .和 软件作正态分析 单因素方差分析()比较多组间差异性 若方差齐使用 法 方差不齐则使用 法 后续两两比较采用 检验 .视为差异有统计学意义 结果与分析.白藜芦醇对镧暴露后仔鼠生长发育的影响体质量的变化能反映仔鼠的生长发育情况 脑质量、
11、海马质量及其相关系数能反映小鼠脑组织的健康状况 随着白藜芦醇干预剂量的增加 各干预组仔鼠灌胃 的体质量、全脑质量、海马质量均逐渐上升 差异具有统计学意义(.)阳性对照组与各白藜芦醇干预组的体质量、全脑质量和海马质量均明显低于对照组 低、中和高剂量组高于阳性对照组 中、高剂量组高于低剂量组 高剂量组高于中剂量组 差异具有统计学意义(.)各干预组仔鼠的脑组织系数和海马组织系数均逐渐上升 差异具有统计学意义(.)阳性对照组与各白藜芦醇干预组的脑组织系数和海马组织系数均明显低于对照组 中、高剂量组高于阳性对照组和低剂量组 高剂量组高于中剂量组差异具有统计学意义(.)结果见表 表 白藜芦醇干预后仔鼠体质
12、量及组织质量组别体质量/脑质量/脑组织系数/海马质量/海马组织系数/对照组.阳性对照组.低剂量 组.中剂量 组.高剂量 组.注:与对照组相比 其他组.与阳性对照组相比 其他组.与低剂量 组相比 其他组.与中剂量 组相比 其他组.白藜芦醇对镧暴露仔鼠学习记忆的影响撤掉水下隐藏的站台 进行空间探索试验 表 显示 与对照组相比 阳性对照组仔鼠在目标象限游泳距离缩短 目标象限的停留时间减少 穿越目标象限和穿越站台次数均减少 差异均具有统计学意义(.)仔鼠穿越目标象限次数和穿越站台次数随着白藜芦醇干预剂量的增加呈现出递增趋势 差异具有统计学意义(.)追踪观察仔鼠的游泳路径发现 各组仔鼠搜索原站台的方法截
13、然不同 如图 所示 对照组仔鼠的目的性较强 在目标站台附近反复穿行 搜寻能力最强穿越目标象限、目标站台的次数和在目标象限停留时间最多 阳性对照组则很少进入目标站台 随着白藜芦醇干预剂量的增加 各剂量组仔鼠寻找站台的趋向性增加 目的性增强 第 期 丁梦平 周 燕 张 雪 等:白藜芦醇对镧神经损伤仔鼠脑内 表达的影响表 空间探索能力检测结果()组别游泳距离/穿越目标象限次数/次目标象限持续时间/穿越隐藏站台次数/次对照组.阳性对照组.低剂量 组.中剂量 组.高剂量 组.注:与对照组相比 其他组.与阳性对照组相比 其他组.与低剂量 组相比 其他线.与中剂量 组相比 其他组.白藜芦醇对镧暴露仔鼠海马组
14、织中 表达的影响荧光实时定量 法测定镧暴露仔鼠的海马组织中的 的表达 结果如图 所示 阳性对照组较对照组仔鼠 表达明显降低 差异具有统计学意义(.)与阳性对照组相比 随着白藜芦醇干预剂量的增加仔鼠 的表达水平逐渐增加 且高剂量明显高于低、中剂量组 差异具有统计学意义(.)注:与对照组相比 其他组.与阳性对照组相比 其他组.与低剂量 组相比 其他组.与中剂量 组相比 其他组.辽东学院学报(自然科学版)第 卷.白藜芦醇对仔鼠海马中 蛋白表达的影响由图 可知 与对照组相比 阳性对照组海马组织的 蛋白表达水平明显降低 差异具有统计学意义(.)随着 干预剂量的增加 仔鼠海马组织的 蛋白表达水平逐渐上升
15、且与阳性对照组相比 低、中和高剂量 组表达水平明显升高 差异具有统计学意义(.)图中、分别代表对照组、阳性对照组、低剂量 组、中剂量 组及高剂量 组注:与对照组相比 其他组.与阳性对照组相比 其他组.与低剂量 组相比 其他组.讨论环境中的 能够进入体内多器官并造成影响 包括引起儿童血压、肺活量下降 免疫功能减退等发育问题 尤其是 进入并蓄积在脑组织中 可影响中枢神经系统正常发育及功能 镧暴露可影响仔鼠的中枢神经系统发育 可能通过上调促凋亡蛋白 的表达促进神经细胞凋亡的发生 进而导致子代雄鼠学习记忆能力下降 本课题组前期研究也表明 氯化镧可以蓄积在仔鼠脑组织中导致仔鼠海马皮质细胞发生氧化应激 从
16、而损伤其空间学习记忆能力 在抗癌、抗氧化的同时还发挥着良好的神经保护作用 具有改善慢性脑缺血、保护神经元及促进认知功能改善的作用 还可改善血管性痴呆大鼠内皮功能障碍、氧化应激增加、炎症和神经营养蛋白表达受损等 从而预防记忆缺陷 具有抗缺氧性脑损伤作用 可通过下调 、蛋白的表达 抑制 途径下游自噬水平 达到促进小鼠缺氧性脑损伤修复的作用本研究结果显示 随着 干预剂量的增加 镧暴露仔鼠的体质量、脑质量、海马质量及其组织系数均逐渐升高 提示 能够改善镧暴露所致仔鼠生长发育不良和脑组织损伤 促进神经系统的正常发育 本研究中 水迷宫空间探索实验结果显示镧暴露后经不同浓度 干预的仔鼠随着 剂量的增加仔鼠在目标象限的停留时间增加游泳距离缩短穿越目标象限次数和穿越站台次数减少表明 可有效改善镧暴露仔鼠的空间学习记忆能力提高其认知功能 该结果与 改善海马神经细胞损伤、保护神经元正常发育密切相关低氧诱导因子 ()是低氧应答时诱导基因表达和恢复细胞内环境稳定的一个核心调节因子 存在于多数动物的细胞中 包含 和 这 个亚单位 前者是 的活性亚基 其蛋白水平和活性决定 的生物作用 在缺氧环境中 可率先被激活 第
