1、农产品质量与安全2023 年第 4 期草莓中农药多残留快速检测技术构建与应用王震宇1高俊霞1陈建波2赵颖3赵莉2郭逸蓉1马琳2渊1.浙江大学农业与生物技术学院农药与环境毒理研究所袁 杭州310058曰2.上海市农业技术推广服务中心袁 上海201103曰3.浙江昊天检测技术服务有限公司袁 杭州311122冤摘要院 为实现草莓中常见农药残留的快速筛查袁 根据竞争型免疫层析分析法袁 开发了吡虫啉尧 噻虫嗪尧 啶虫脒尧 克百威尧 多菌灵尧 吡唑醚菌酯尧 异菌脲尧 嘧霉胺共 8 种农药残留检测的胶体金免疫层析试纸条遥 根据目标农药的油水分配系数袁优化了样品提取溶剂袁 构建了一套针对试纸条速测的前处理方法
2、袁 能在 30 min 内完成整个检测遥 该速测法对目标农药的检出限满足 GB 27632021 叶食品安全国家标准食品中农药最大残留限量曳 规定的草莓上对应农药的最大残留限量要求袁 与仪器检测结果符合率逸97.5袁 假阴性率和假阳性率均臆2.5遥 本研究构建的草莓中农药多残留快速检测技术操作简便尧 易于普及袁 可用于基层现场抽检和农户自检遥关键词院 草莓曰 农药残留曰 快速检测曰 胶体金免疫层析试纸条曰 样品前处理基金项目院 上海市科技兴农项目渊202002080008F01456冤遥作者简介院 王震宇 渊2001冤袁 从事农药残留免疫速测方法研究遥 Email院 遥 马琳 渊1980冤袁农
3、艺师袁 从事农药残留分析及农产品安全监管技术研究遥 Email院 渊通讯作者冤遥草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物袁 因其果实风味独特尧 营养价值高袁 有 野水果皇后冶 的美誉1袁故具有重要的经济价值遥 近年来袁 我国草莓种植面积和产量逐年增加袁 截至2022年袁 根据国家统计局数据袁 草莓种植面积达到13.024万hm2袁 产量达342.22万t袁 均为世界第一2遥 草莓上常见病虫害有灰霉病尧 白粉病尧 叶斑病尧 炭疽病尧 蓟马和红蜘蛛等3遥 经中国农药信息网查询袁 截至2023年5月袁 共有146种农药取得在草莓上的登记许可遥 根据GB 27632021叶食品安全国家标准食品中农药最大残留限
4、量曳 规定袁 现有草莓中最大残留限量渊Maximum residue limits袁MRL冤 接近170项遥 调研发现在实际生产过程中袁 种植户往往根据经验和农药销售商推荐来用药袁 导致用药种类多尧 次数频繁尧 施药时间不合理袁 容易带来草莓中农药残留超标问题4遥 另一方面袁 农药生产者为保证药剂防治效果袁 有时会违规添加禁用的高毒农药袁 导致草莓中有禁限用农药检出或超标的现象5遥 因此袁 有必要加快草莓上常见农药残留快速检测技术的开发与推广应用袁 以满足生产者自检尧 基层抽检尧 市场监管等需求遥农药残留检测主要采用经典的大型仪器分析法袁 如色谱法和色谱质谱联用方法袁 但这些大型仪器分析法存在
5、设备昂贵尧 需专人操作尧 检测出结果时间较久等问题袁 难以满足草莓等鲜食农产品中农药残留现场速测的需求6遥 酶抑制法和免疫分析方法是常见的农药残留快速检测技术袁 但是酶抑制法灵敏度较低尧 只能检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药7袁 而免疫分析方法可根据各个农药抗原抗体的特异性反应袁 利用发光材料 渊如纳米金尧 量子点尧碳颗粒尧 荧光染料等冤 标记抗体产生反应信号变化袁 来实现对目标农药的快速检测8遥 其中袁 胶体金免疫层析试纸条技术具有成本较低尧 携带方便尧检测速度快尧 灵敏度高等优点910遥 目前袁 关于草莓上多种农药残留快速检测的免疫层析试纸条技术的研究报道较少袁 市面上虽有少量相关检测产品袁
6、但尚未获得行政许可袁 产品性能无法保证11袁 特别是针对不同种类农药的样品前处理方法的可靠性未知遥 因此袁 本研究以草莓上常检出的8种杀菌剂或杀虫剂 渊多菌灵尧 吡唑醚菌酯尧 异菌脲尧 嘧霉胺尧吡虫啉尧 噻虫嗪尧 啶虫脒尧 克百威冤 为待测农药袁利用前期获得的各农药抗原和抗体袁 开发胶体金免农产品质量与安全2023 年第 4 期疫层析试纸条速测技术袁 同时建立适用于胶体金免疫层析试纸条速测法的草莓样品前处理方案袁 旨在实现对草莓中多种常见农药残留的现场快速筛查遥一尧 材料与方法渊一冤 材料与试剂吡虫啉尧 啶虫脒尧 噻虫嗪尧克百威尧 多菌灵尧 吡唑醚菌酯尧 异菌脲尧 嘧霉胺的人工抗原和单克隆抗体
7、 渊浙江大学农业与生物技术学院农药与环境毒理研究所冤曰 牛血清白蛋白渊BSA冤尧 柠檬酸三钠尧 氯金酸溶液 渊美国Sigma公司冤曰 羊抗鼠二抗 渊北京博奥龙免疫技术有限公司冤曰 聚乙二醇 渊PEG冤20000尧 聚乙烯吡咯烷酮渊PVP冤尧 吐温20渊上海Aladdin公司冤曰 硝酸纤维素 渊NC冤 膜 渊德国Sartorius公司冤曰 样品垫尧 吸水纸尧 聚氯乙烯渊PVC冤底板渊5 cm/8 cm冤渊杭州韩感科技有限公司冤曰0.2 mol/L碳酸钾溶液尧0.01 mol/LPBS缓冲液 渊pH 7.4冤尧 样品垫处理液尧 金标封闭液尧 金标复溶液均为实验室自制遥渊二冤 仪器与设备智能干燥柜
8、渊132 L袁 台湾爱保公司冤曰 紫外可见光分光光度计 渊UV2550袁 日本岛津公司冤曰 单通道及多通道可调移液器 渊德国Eppendorf公司冤曰 万分之一天平 渊德国Sartorius公司冤曰 超纯水仪 渊美国Pall公司冤曰 台式高速离心机 渊Allegra 64R袁 美国Beckman公司冤曰Thermo台式离心机 咱赛默飞世尔科技 渊中国冤 有限公司暂曰 多功能酶标仪 渊SpectraMaxi3袁 美国Molcular Devices公司冤曰 激光粒度仪 渊Mastersizer2000袁 英国马尔文仪器有限公司冤曰 高速匀浆机渊IKATl8袁 德国IKA公司冤曰 除湿机 渊DH1
9、66BC袁杭州川井电气有限公司冤曰 自动切条机 渊C6袁 杭州韩感科技有限公司冤曰 喷金划膜一体机 渊T2DDA袁杭州韩感科技有限公司冤遥渊三冤 实验方法1.胶体金标记抗体复合物的制备遥 采用柠檬酸三钠还原氯金酸得到胶体金溶液袁 通过调节柠檬酸三钠用量来控制合成的胶体金颗粒大小袁 比较不同粒径的胶体金与抗体结合的稳定性及其在试纸条上显色情况袁 最终选择粒径为25 nm尧 最大吸收波长为521 nm的胶体金溶液用于标记各农药单克隆抗体12遥各取1 mL胶体金溶液若干份袁 添加不同体积的0.1 mol/L碳酸钾溶液使得各胶体金溶液pH分别为6.0尧6.5尧7.0尧7.5尧8.0和8.5袁 再分别加
10、入0.1 mL的50滋g/mL抗体遥 室温静置2 h后袁 各胶体金溶液加入0.1 mL的10氯化钠溶液袁 用酶标仪测定氯化钠加入前尧 加入后1560min的吸光值渊OD521 nm冤 变化袁 以吸光值变异系数最小的胶体金溶液所对应的pH为抗体的最佳标记pH1213遥根据上述所得最适标记pH袁 进一步优化待测农药抗体与胶体金的结合量遥 在各100滋L超纯水中配置系列梯度的抗体溶液袁 将各浓度的抗体分别加入1 mL最适pH的胶体金溶液中袁 室温孵育1h遥 再加入由1PEG和10BSA配制的金标封闭液 渊0.1 mL冤 后再孵育1 h袁 然后以8 000 r/min离心30 min后弃上清袁 用0.
11、1 mL金标复溶液重悬得到胶体金标记抗体复合物遥 通过测试空白对照溶液和农药加标溶液袁 裸眼观察试纸条质控线 渊C线冤与检测线 渊T线冤 的显色及T线抑制情况袁 确定合适的抗体标记添加量14遥2.试纸条组装遥 试纸条划线大板由PVC底板尧吸水纸尧 样品垫以及金标结合垫等部分组成 渊见图1冤遥 组装前袁 将样品垫在其处理液中浸润后取出袁37干燥备用遥 选用6 mm伊30 cm规格的金标垫袁用1 mL金标抗体溶液喷涂均匀袁37干燥备用遥然后袁 将NC膜贴在PVC底板上袁 再将上述样品垫尧 金标结合垫和吸水垫叠加贴在PVC底板上遥使用金标划线仪喷涂农药人工抗原 渊即竞争抗原冤作为T线袁 羊抗鼠二抗作
12、为C线袁 设置C尧T线间距为5 mm遥 最后将组装好的试纸条大板在37烘箱中过夜袁 使用切条机将大板切成宽3 mm的试纸条带袁 装入含干燥剂的密封袋中袁4干燥保存遥3.试纸条参数优化遥 通过调节包被在T线和C线的竞争抗原和二抗的工作浓度袁 控制T尧C线的显色情况遥 采用类似于竞争型酶联免疫吸附测定渊ELISA冤 的棋盘法试验袁 筛选出包被试剂最优的工作浓度条件袁 即在空白对照溶液测试的试纸条上C尧T线显色清晰且接近袁 而在农药浓度从低到高的加标溶液测试时T线颜色逐渐变浅至消失15遥4.样品快速前处理方法的构建与优化遥 每批草图 1试纸条组装示意图1PVC 底板 曰 2吸水垫曰 3质控线 渊C
13、线冤曰 4检测线 渊T 线冤曰5NC 膜曰 6金标结合垫曰 7样品垫1234567农产品质量与安全2023 年第 4 期莓样品随机挑选58颗摘去萼片袁 使用匀浆机将其匀质袁 称取2 g草莓样品至15 mL离心管袁 加入2 mL提取溶剂袁 选择涡旋或剧烈振荡1 min使草莓中待测农药充分提取袁 以4 000 r/min离心3 min后取上清液稀释适当倍数制成待测液袁 取100滋L待测液滴于检测试纸条样品垫上袁 反应10 min后裸眼观察C尧T线显色结果遥采用农药添加回收试验进行前处理方法的优化袁 添加水平为草莓上各待测农药的MRL值遥 综合考虑草莓基质组分尧 各待测农药的油水分配系数以及NC膜对
14、于有机溶剂的耐受性等因素袁 选择免疫分析法常用的助溶剂甲醇作为提取农药的有机溶剂16袁 按照10或20甲醇PBS和纯甲醇分别进行提取袁 离心后设置不同的稀释倍数制成待测液袁 比较试纸条对于空白对照样品和农药加标样品测试的显色情况袁 并结合液相色谱质谱联用渊LCMS/MS冤 仪器法测试提取效果来确定合适的提取溶剂和稀释倍数遥5.样品测试与结果判定遥 根据竞争型免疫层析法的工作原理进行样品中目标农药的测试袁 即100滋L待测液随着层析流动与金标抗体接触反应袁 继续层析向上扩散至试纸条吸水垫段袁 携带有胶体金标记物的抗体分别与T线和C线上捕获物结合遥当T线显色比C线显色深或显色一致袁 表示样品中不含
15、相应农药或其浓度低于检测限袁 结果为阴性曰 当T线显色明显浅于C线或T线不显色袁 表示样本中被测农药浓度等于或高于检测限袁 结果为阳性曰 当C线不显色袁 证明试纸条失效袁 结果无效 渊见图2冤遥6.速测法的性能评价遥 渊1冤 试纸条特异性院 将吡虫啉等8种待测农药的常见代谢物尧 结构类似物或功能类似物分别用20甲醇PBS稀释配制成一系列梯度 渊如0.01尧0.05尧0.1尧0.5尧1.0尧5.0滋g/mL冤的标准溶液进行试纸条检测袁 观察交叉反应情况袁评价试纸条的特异性遥 渊2冤 方法检出限院 向草莓空白样品中分别添加从低到高不同浓度 渊待测农药的1/20尧1/10尧1/5尧1/2 MRL和M
16、RL冤 的吡虫啉等8种农药标准溶液袁 每个添加水平重复3次遥 按优化后的样品前处理方法操作袁 分别取100滋L样品待测液用于试纸条检测袁T线不显色或显色开始很浅时的最低档浓度为方法对待测农药的检出限遥 渊3冤方法准确性院 市场随机抽检40份草莓样品袁 同时进行试纸条速测法和LCMS/MS仪器参比方法检测袁 比对两种检测方法结果的一致性遥 仪器参比方法采用GB 23200.1212021叶食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱质谱联用法曳 标准方法遥二尧 结果与分析渊一冤 各农药试纸条制备与灵敏度测试1.胶体金标记抗体条件和试纸条包被试剂浓度的优化遥 根据实验方法所述步骤袁 优化获得了胶体金标记各农药单克隆抗体的最适pH和抗体添加量袁 以及各农药检测试纸条所需T线包被抗原和C线包被二抗的工作浓度袁 详见表1遥 由于各农药单克隆抗体及相应人工抗原的蛋白活性有所差异袁 所需的工作条件与具体参数不同袁 说明胶体金标记抗体和试纸条制备的优化步骤很有必要遥2.各农药试纸条对标准溶液的检出限遥 采用优化条件下制备的试纸条测试各农药梯度稀释的标准溶液袁 得到各农药试纸
