1、第 31 卷 第 3 期厦门理工学院学报Journal of Xiamen University of TechnologyVol.31 No.32023 年 6 月Jun.2023GIRK2通道外流门控机制的分子动力学模拟王瑞，赵伊婷，石定媛，李岱霖*，林嫣（厦门理工学院环境科学与工程学院，福建 厦门 361024）摘 要为深入理解外流调控型病理或药效机制，采用全原子分子动力学模拟方法，在外向电场作用下，对不同因子（Na+、G、Na+-G）调控下的GIRK2通道进行微秒级分子动力学模拟，揭示GIRK2通道的外向电流门控机制。结果表明：Na+和G亚基协同作用激活GIRK2通道，Na+使得GIR
2、K2通道G-loop门控打开概率高达 94.6%，显示出 G-loop 门控的调节作用；G 主要影响 HBC 门控，使其打开概率为73.6%。CTD结构域内向摆动约148.8和TM2-CTD逆向旋转约11.9可导致G-loop门激活，而CTD外向摆动和TM2外向倾斜约38.3导致HBC门激活。关键词GIRK2通道；外流门控机制；分子动力学中图分类号X172；Q615 文献标志码A 文章编号1673-4432（2023）03-0088-08A Molecular Dynamics Simulation for Outward Current-Gated Mechanism of GIRK2 Ch
3、annelWANG Rui,ZHAO Yiting,SHI Dingyuan,LI Dailin*,LIN Yan(School of Environmental Science&Engineering,Xiamen University of Technology,Xiamen 361024,China)Abstract:An all-atom molecular dynamics simulation was used to simulate the molecular dynamics of GIRK2 channel under the regulation of different
4、factors(Na+,G,Na+-G)under the action of external electric field,by which the outward current-gated mechanism of GIRK2 channel was revealed and the mechanism of pathological regulation and drug regulation mediated by GIRK2 channels better understood.The results show that Na+and G receptor subunits sy
5、nergistically activated GIRK2 channel,in which the Na+makes GIRK2 channel G-loop gating open probability as high as 94.6%,showing the regulatory effect of G-loop gating,and G mainly regulates HBC gating to make 73.6%of its open probability.The activation of G-loop gating is due to the inward swing o
6、f the CTD domain at about 148.8 and the reverse rotation of TM2-CTD at about 11.9,while the extroverted swing of CTD and the outward tilt of TM2 at about 38.3 leads to HBC gate activation.Key words:GIRK2 channel;outward current-gated mechanism;molecular dynamicsG蛋白门控内向整流钾离子（G Protein-Gated Inwardly
7、Rectifying K+，GIRK）通道通过细胞兴奋性doi:10.19697/ki.1673-4432.202303013收稿日期：20221120 修回日期：20230515基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（42106224）；福建省自然科学基金项目（2020J01259）；福建省大学生创新训练项目（S202211062015）；厦门理工学院科技创新计划项目（YKJCX2021166）通信作者：李岱霖，男，讲师，博士，研究方向为生物分子动力学模拟，E-mail：。引文格式：王瑞，赵伊婷，石定媛，等.GIRK2通道外流门控机制的分子动力学模拟 J.厦门理工学院学报，2023，31（3
8、）：88-95.Citation:WANG R,ZHAO Y T,SHI D Y,et al.A molecular dynamics simulation for outward current-gated mechanism of GIRK2 channel J.Journal of Xiamen University of Technology,2023,31(3):88-95.(in Chinese)第 3 期王瑞，等：GIRK2通道外流门控机制的分子动力学模拟调节在神经系统或组织器官的G蛋白信号通路调控方面发挥重要作用，在神经递质释放、成瘾药物研制表现出极具前景的靶向治疗潜力1-3。
9、细胞兴奋性调节通过与多种耦联受体结合介导胞内外K+传递实现4-5。该传导过程受限于通道状态，当通道受到激活而使门控呈现打开状态时，允许K+实现选择性穿越迁移。因此，探究门控调节机制对于深入理解相关病理、药效机制，开发特异性靶向治疗调节剂具有重要意义。作为GIRK家族成员，GIRK2通道的X射线晶体结构于2011年被首个解析，得到结构生物学研究广泛关注。GIRK2 结构组成包括跨膜区（Transmembrane domain，TM）和细胞溶质区（Cytosolic domain，CTD）。K+的外向迁移须穿越三个限制性结构域：CTD顶端的G-loop门控、螺旋束交叉门控（Helix Bundle
10、 Crossing，HBC）、高度保守的选择性过滤器（Selectivity Filter，SF）6。门控激活依赖于细胞膜上磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol（4，5）Bisphosphate，PIP2）的稳定作用和激活因子调控7-8。目前，GIRK2通道已发现的激活因子包括Na+9、G蛋白亚单位（G）10、乙醇11等。考虑到内向整流特性，关于GIRK2通道的门控机制研究均以K+内流为前提。通过晶体结构叠合提出了 CTD 结构域相对 TM 的逆向旋转机制可激活 GIRK2 通道12。此外，分子动力学研究结果表明，GIRK2通道通过CTD摇摆、逆向旋转、TM2倾斜运动被激活，其
11、中HBC门控激活是CTD的摇摆和TM2的倾斜导致，而G-loop门控由于CTD结构域的逆向旋转和向内摆动激活6，13-14。尽管GIRK2通道的内流机制得到深入研究，但与之相对的外流门控机制未见报道。已有研究表明，利用离子通道外向电流阻滞或激活已成功研制出众多药物分子，如dofetilide15、cromakalim、nicorandil16等，可见外流机制研究对于探讨药效机制是必要的。本文借助分子力学、分子动力学理论，以GIRK2通道为对象，在双层脂膜环境下探究不同因子调控下的构效关系，揭示GIRK2的外流门控机制，为GIRK家族的通道激活调节机制研究提供结构生物学信息，以助于深入理解外流调
12、控型病理或药效产生机制。1GIRK2体系分子动力学模型搭建为了探究饱和浓度配比下GIRK2通道的外流门控调节机制，选取GIRK2通道（蛋白质数据库代码：4KFM17）晶体结构为初始结构模板，如图1所示。对于未饱和浓度配比下，考虑GIRK2通道空间位阻和双层脂膜的锚定效应等因素，使得PIP2、G与GIRK2的结合位点固定、单一，致使其实验条件众多，计算和分析量巨大，本文仅讨论外向图1GIRK2通道晶体结构图17Fig.1Crystal structure of GIRK2 channel1789厦门理工学院学报2023 年电场作用下GIRK2的门控机制17。通过化学修饰增删内源性调节因子PIP2
13、、Na+、G搭建3个初始模 型：GIRK2-PIP2-Na+（GIRK2-Na+）、GIRK2-PIP2-G（GIRK2-G）、GIRK2-PIP2-G-Na+（GIRK2-Na+-G），GIRK2的模型搭建与计算具体如图2所示。使用H+服务器（http：/biophysics.cs.vt.edu/）添加残基支链缺失的氢原子18，在生理条件（pH=7.0）下通过计算各残基的pKa确定残基质子化状态。将GIRK2复合物浸没在1-棕榈酰-2-油酰-Sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-油酰-Sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰-Sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸和胆固醇构成的显式双层脂
14、膜（分子比为25 5 5 1）19。添加显示水溶剂（GIRK2-Na+、GIRK2-G、GIRK2-Na+-G溶剂盒子尺寸分别为116 116 150、162 162 170、162 162 170）和150 mmolL-1 KCl溶液的生理环境。据此搭建的 3个模拟体系，调节因子 PIP2、G、Na+的初始浓度约 2 4 mmolL-1，因子与GIRK2的配位比4 1。针对复合物模型中的蛋白质、脂膜、调节因子，分别采用FF14SB、Lipid17和GAFF2力场20描述原子受力和运动情况。据此搭建的模拟体系包含160 000到400 000个原子。本文以外向电场下分子动力学平衡轨迹为对象，进
15、行钾离子运动轨迹、通道距离、结构域几何参数分析。运动轨迹主成分分析和几何参数计算分别借助AmberTools17和MDAnalysis 0.18软件21实现。通道结构绘制借助VMD1.9.3软件包完成22。所有计算在配备英伟达GTX 1080图形卡的服务器中进行。计算环境为 Community Enterprise Operating System（CentOS）7 和 NVIDIA Compute Unified Device Architecture（CUDA）8.0。2微秒尺度全原子分子动力学模拟对搭建好的3个初始模型分别进行几何优化及微秒尺度全原子分子动力学模拟（将体系每个原子当做一个
16、小球，求解体系牛顿力学方程）计算。首先，对模型体系进行能量最小化计算；其次，对体系依次进行升温、平衡动力学计算；最后，在外向电场下进行平衡动力学等。能量最小化采取最速下降算法（10 000步）和共轭梯度算法（10 000步）。体系升温采用Langevin恒温算法，时间步长0.5 fs以避免内部扰动。平衡模拟首先在无电场条件下，采取恒温恒压系综进行0.2 s，而后在外向电场（跨膜电压约200 mV）23-24及恒温恒容系综进行0.5 s。该电压在GIRK2二级结构保持完好情况下用以促进K+外流，更高的外电场会导致结构不稳定。长程静电作用采取Particle-Mesh Ewald方法，设图2GIRK2的模型搭建与计算Fig.2Model building and calculation of GIRK290第 3 期王瑞，等：GIRK2通道外流门控机制的分子动力学模拟定截断值为10。借助溶质的氢质量重分配算法25，以4 fs为时间步长加速分子动力学模拟，并对溶剂采用SHAKE算法。模拟工作借助AMBER16中的PMEMD.CUDA程序完成。3实验结果与讨论3.1Na+和G亚基协同作用激活G
