1、第5 1卷 第1 0期2 0 2 3年1 0月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t.S c i.E d.)V o l.5 1 N o.1 0O c t.2 0 2 3网络出版时间:2 0 2 3-0 4-1 0 1 2:0 9 D O I:1 0.1 3 2 0 7/j.c n k i.j n w a f u.2 0 2 3.1 0.0 0 3网络出版地址:h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/6 1.1
2、 3 9 0.S.2 0 2 3 0 4 0 7.1 6 3 3.0 0 5.h t m l4种致牛腹泻病毒多重荧光定量P C R检测方法的建立及应用 收稿日期 2 0 2 2-0 6-3 0 基金项目 陕西省重点研发计划一般项目(2 0 2 2 NY-0 9 8)作者简介 高 睿(1 9 7 7-),女,陕西长安人,副教授,硕士,主要从事分子病原学研究。E-m a i l:2 4 9 1 0 5 4 1 4q q.c o m 通信作者 张 琪(1 9 7 7-),女,陕西杨凌人,副教授,博士,主要从事牛病学研究。E-m a i l:2 7 3 0 1 0 4 6 6q q.c o m高 睿1
3、,徐 伟2,罗 艳1,谢晓刚1,李梦磊3,张 琪3(1 杨凌职业技术学院 动物工程分院/动物疫病防控陕西省高校工程研究中心,陕西 杨凌 7 1 2 1 0 0;2 陕西省彬州市动物疫控中心,陕西 彬州 7 1 3 5 0 0;3 西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 7 1 2 1 0 0)摘 要【目的】建立牛病毒性腹泻病毒(B V D V)、牛冠状病毒(B C o V)、牛轮状病毒(B R V)、牛恶性卡他热病毒(MC F V)4种致牛腹泻病毒多重荧光定量P C R检测方法,为B V D V、B C o V、B R V和MC F V的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据B V D V的5
4、U T R基因、B C o V的N基因、B R V的V P6基因和MC F V的O R F9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量P C R检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量P C R检测方法对7 6份临床样品进行检测,并与常规P C R检测方法的结果进行比较。【结果】建立了B V D V、B C o V、B R V和MC F V多重荧光定量P C R检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对B V D V、MC F V、B R V和B C o V的最低
5、检出限分别为9.41 01,1.41 03,9.11 01和1.21 02拷贝/L,与普通P C R相比,灵敏性高出1 01 0 0 0倍;批内、批间差异均小于5%。7 6份临床样品检测结果显示,多重荧光定量P C R检测结果与普通P C R检测结果的符合率分别为9 8.7%(B C o V)、9 7.4%(B R V)、1 0 0.0%(B V D V)和1 0 0.0%(MC F V)。【结论】建立了B V D V、B C o V、B R V和MC F V多重荧光定量P C R检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。关键词 牛腹泻病;牛病毒性腹泻病毒
6、;牛冠状病毒;牛恶性卡他热病毒;牛轮状病毒;多重荧光定量P C R检测 中图分类号 S 8 5 2.6 5+3 文献标志码 A 文章编号 1 6 7 1-9 3 8 7(2 0 2 3)1 0-0 0 2 0-0 9E s t a b l i s h m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f m u l t i p l e f l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e P C R f o r d e t e c t i o n o f 4 b o v i n e d i a r r h e a v i r u
7、s e sGAO R u i1,XU W e i2,L UO Y a n1,X I E X i a o g a n g1,L I M e n g l e i3,Z HANG Q i3(1 D e p a r t m e n t o f A n i m a l E n g i n e e r i n g,Y a n g l i n g V o c a t i o n a l&T e c h n i c a l C o l l e g e/E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r o f A n i m a l D i s e a s e
8、P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l U n i v e r s i t i e s o f S h a a n x i P r o v i n c e,Y a n g l i n g,S h a a n x i 7 1 2 1 0 0,C h i n a;2 A n i m a l E p i d e m i c C o n t r o l C e n t e r o f B i n z h o u C i t y,S h a a n x i P r o v i n c e,B i n z h o u,S h a a n x i 7 1 3 5 0
9、0,C h i n a;3 C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i 7 1 2 1 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】W i t h t h e v i g o r o u s d e v e l o p m e n t o f c a t t l e i n d u s t r y,t h e p r o b l e m
10、 o f b o v i n e d i a r-r h e a c a u s e d b y v i r u s e s i s b e c o m i n g m o r e a n d m o r e s e r i o u s a n d s e r i o u s l y r e s t r i c t s t h e h e a l t h y d e v e l o p m e n t o f c a t t l e i n d u s t r y.I n t h i s s t u d y,a m u l t i p l e x f l u o r e s c e n t q
11、 u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n m e t h o d f o r b o v i n e d i a r-r h e a v i r u s e s o f B V D V,B C o V,B R V a n d MC F V w a s e s t a b l i s h e d.【M e t h o d】P r i m e r s w e r e d e s i g n e d a c c o r d i n g t o t h e c o n s e r v e d r e g i o n s o f t h e 5 U T
12、 R g e n e o f B V D V,t h e N g e n e o f B C o V,t h e V P6 g e n e o f B R V a n d t h e O R F9 g e n e o f MC F V,a n d t h e t a r g e t g e n e w a s c l o n e d t o c o n s t r u c t a s t a n d a r d p o s i t i v e r e c o m b i n a n t p l a s-m i d.A m u l t i p l e x f l u o r e s c e n
13、t q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n m e t h o d w a s e s t a b l i s h e d t o s i m u l t a n e o u s l y d e t e c t 4 b o v i n e d i a r r h e a v i r u s e s.T h e s p e c i f i c i t y,s e n s i t i v i t y a n d r e p e a t a b i l i t y o f t h e m e t h o d w e r e e v a l u
14、a t e d.A t o t a l o f 7 6 c l i n i c a l s a m p l e s w e r e d e t e c t e d w i t h t h e e s t a b l i s h e d m e t h o d,a n d t h e r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e o f c o n v e n t i o n a l P C R.【R e s u l t】A m u l t i p l e x f l u o r e s c e n t q u a n t i t
15、 a t i v e P C R a s s a y f o r B V D V,B C o V,B R V a n d MC F V w a s e s t a b l i s h e d.T h e s t a n d a r d c u r v e e s t a b l i s h e d b y t h i s m e t h o d h a d a g o o d l i n e a r r e l a t i o n s h i p a n d o n l y 4 t a r g e t g e n e f r a g m e n t s c o u l d b e a m p
16、l i f i e d s p e c i f i c a l l y.T h e l o w e s t d e t e c t i o n l i m i t s f o r B V D V,MC F V,B R V a n d B C o V w e r e 9.41 01,1.41 03,9.11 01 a n d 1.21 02 c o p i e s/L,r e s p e c t i v e l y.T h e s e n s i t i v i t y w a s 1 0-1 0 0 0 t i m e s h i g h e r t h a n t h a t o f o r d i n a r y P C R.T h e i n t r a b a t c h a n d i n t e r b a t c h d i f f e r e n c e s w e r e l e s s t h a n 5%.T h e r e s u l t s o f 7 6 c l i n i c a l s a m p l e s s h o w e d t h a t t
