1、收稿日期 修回日期 作者单位 蚌埠医学院 生命科学学院，安徽 蚌埠；贵州大学 绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地，贵州 贵阳 作者简介 周红玲（），女，硕士研究生通信作者 黄银久，硕士研究生导师，教授：文章编号（）药学新型杨梅素衍生物 的合成及抗肿瘤活性研究周红玲，薛 伟，黄银久摘要目的：评价新设计合成的杨梅素衍生物 对人肝癌 细胞的抗肿瘤活性，以期为杨梅素衍生物的结构优化和抗肝癌药的进一步研发提供依据。方法：以杨梅素为母体，通过化学反应合成，并用核磁共振（）和高分辨质谱（）进行结构和定量分析，再验证其抗肿瘤活性：将不同浓度的 和阳性对照药吉西他滨作用于 细胞，作为阴性对照组，通过
2、实验和形态学观察检测 对 细胞的增殖抑制作用，划痕实验检测 细胞迁移能力，流式细胞术检测 细胞周期和细胞凋亡。结果：和 确定了 氟苄基（，二甲氧基氧代（，三甲氧基苯基）色烯基）氧基）丙基）（甲基）氨基）哌啶二硫代羧酸（）的分子结构，其化学式为。的抗肿瘤活性实验表明：与对照组相比，不同浓度下，的抑制活性更高，差异均具有统计学意义（）；能抑制 细胞迁移（）；使 细胞的细胞周期阻滞在 期（）；能诱导 细胞凋亡（）。结论：成功合成，其能通过抑制 细胞增殖和迁移，诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥其体外抗肿瘤作用。关键词 杨梅素衍生物；肝肿瘤；细胞；抗肿瘤活性中图法分类号 文献标志码 ：，（，；，）：，：，（）
3、（），：，：（，（，）（）（）：，；（）（）；（）：；肝癌是一种常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的生命健康。肝癌在我国尤其高发，是 年第 位的常见恶性肿瘤和第 位的肿瘤致死病因。化疗是肝癌的主要治疗手段之一，但由于个体差异性和耐药性，相当一部分肝癌病人并不能达到理想的治疗效果，因此有必要筛选出更加敏感、高效的新型抗肝癌药物。杨梅素是一种广泛存在于植物界的天然生物活性物质，因最早从杨梅树皮中提取而得名，其化学式为。杨梅素对多种癌细胞如结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌 蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期等均有很好的抗肿瘤活性。但杨梅素的水溶性和脂溶性较差，这限制了杨梅素类药物的开发及临床应用。为了
4、弥补这一不足，研究者们对其结构改造得到了各种类型的杨梅素衍生物。本课题组以杨梅素为母体合成一种新型杨梅素衍生物，之后通过体外细胞实验进一步验证该化合物的抗肿瘤活性，以期为杨梅素衍生物的结构优化和抗肝癌药的进一步研发提供理论和实验依据。现作报道。材料与方法 的合成 化学名称是 氟苄基（，二甲氧基氧代（，三甲氧基苯基）色烯基）氧基）丙基）（甲基）氨基）哌啶二硫代羧酸，化学式为，具体合成办法分为以下 个步骤：（）在 烧瓶中加入杨梅苷（）、（），常温下搅拌 后，缓慢滴加碘甲烷（），继续搅拌 ，跟踪反应（甲醇：乙酸乙酯 ，）。反应停止后，过滤沉淀，用二氯甲烷洗涤滤渣，合并滤液，用 水稀释，用二氯甲烷萃取
5、 次，合并有机层，减压浓缩，然后将浓缩物溶于 无水乙醇中，升温至回流，待溶液澄清后，回流下加入 浓盐酸，随后有黄色固体析出，继续反应 ，冷却，过滤，得到粗产物 羟基，五甲氧基杨梅素（中间体）（见图），产率：。（）在 烧瓶中加入中间体 （）、（），常温搅拌 后，加入，二溴丙烷（），继续反应 ，监测反应（乙酸乙酯）。反应停止后，反应液用 的水分散，有白色固体析出，抽滤，再将固体加入装有 溶液（乙酸乙酯：正己烷 ）的烧瓶中常温搅拌 ，抽滤，减压柱层析分离提纯（石油醚：乙酸乙酯 ，）得到白色固体（溴丙氧基），二甲氧基（，三甲氧基苯基）色烯酮（中间体）（见图），产率：。（）在 烧瓶中加入（）、（甲基）氨
6、基 哌啶（）、乙腈 ，常温搅拌 后加入中间体（），随后升温至 ，继续搅拌 ，跟踪反应。反应结束后，冷却至室温，抽滤除去碳酸钾及固体杂质，减压除去溶剂，得到酒红色油状粗产物（，二甲氧基氧代（，三甲氧基苯基）苯并吡喃基）氧基）丙基）（甲基）氨基叔丁基）哌啶羧酸叔丁酯（中间体）备用（见图），产率：。（）中间体 用约 甲醇溶于 的烧瓶中，再加入盐酸甲醇溶液（），常温搅拌约 ，跟踪反应。反应结束后，减压除去溶剂后加入少量甲醇溶解，再加入乙酸乙酯，不断搅拌至有黄色固体析出，抽滤，再分别用乙酸乙酯，二氯甲烷洗涤，自然风干得到黄色固体，二甲氧基（甲基（哌啶基）氨基）丙氧基）（，三甲氧基苯基）色烯酮的盐酸盐（中
7、间体）（见图），产率：。（）在 烧瓶中加入中间体（）、（）、乙腈 ，常温搅拌 后在冰浴条件下滴加二硫化碳（），继 续 搅 拌 后 缓 慢 滴 加 邻 氟 苄 氯（），继续冰浴搅拌 ，跟踪反应。反应结束后将混合物倒入 冰水中，用二氯甲烷萃取（），合并有机层，用饱和食盐水洗涤（）、无水硫酸钠干燥、减压除去溶剂，得粗产物，经柱层析（乙酸乙酯：甲醇：，）提纯得到目标化合物 氟苄基 （，二甲氧基氧代（，三甲氧基苯基）色烯基）氧基）丙基）（甲基）氨基）哌啶二硫代羧酸（）（见图），产率：。获得化学式和分子量数据将上述合成的目标化合物（）作为样品，以 为溶剂，用核磁共振（）测定并获得其在 （）、（）、（）的谱
8、图数据，再用高分辨质谱（）测定并获得该目标化合物的化学式和分子量数据。细胞株及主要试剂人肝癌 细胞；高糖培养基；胎牛血清（）；二甲基亚砜（）；青链霉素混合液（双抗）；胰酶；溶液；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒。细胞培养与药物作用 人肝癌 细胞于 、的培养箱中用配成的含 胎牛血清和 青链霉素混合液的完全培养基培养。和吉西他滨先用 稀释成、的贮存液，加药时再用完全培养基或无血清培养基稀释成工作液，吉西他滨作为阳性对照组，作为阴性对照组。实验检测抑制率对数生长期细胞 胰酶消化后加入完全培养基终止消化，离心，弃上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀。取 孔板，板的前 列作为药物处理组，板的后 列作为对照组（分
9、别是阴性对照组和空白对照组），前 ，列的中间 行每孔各加入（含 个细胞）的细胞悬液，最后一列及板四周未加细胞悬液的每孔加入 以保证板的饱和湿度，将 孔板置于 、的培养箱中培养 。后等细胞完全贴壁进行加药处理，即取出 孔板，弃去培养基，前 列每列的中间 个孔按顺序分别加入稀释好的浓度分别为 、吉西他滨 、吉西他滨 、吉西他滨 、吉 西 他 滨 、吉 西 他 滨 的 药 物，每 孔，最后 列除了第一个和最后一个孔外阴性对照组每孔加入用完全培养基稀释好的 ，空白对照组每孔加入完全培养基 ，板四周其余未加任何液体的各孔则分别加入 以保证板的饱和湿度，再将板置于 、的培养箱中培养。后，在倒置显微镜下观察
10、药物作用效果并拍照，然后弃去板内药液，板的 列的中间 行每孔各加入 的 溶液，加完轻轻晃动一下板使 充分混匀，再将板置于培养箱中培养 。后 孔板内生成紫色结晶甲瓒再弃去板内，原先加 的每孔加入 以溶解甲瓒结晶，之后将板置于摇床振荡器中摇板 ，用酶标仪测定在 处的吸光度值并计算抑制率。抑制率（）（处理组吸光度值 空白对照组吸光度值）（阴性对照组吸光度值 空白对照组吸光度值）。用 软件绘制细胞抑制率与对数浓度之间的非线性回归图，并用 软件测定半抑制浓度（）。形态学观察 上述 孔板在加药后于培养箱中培养 后拍照，比较 组和吉西他滨组的细胞在形态学上的差异。划痕实验检测细胞迁移能力（）对数生长期细胞，
11、胰酶消化后加入完全培养基终止消化，离心，弃上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀。取一块 孔板，其中 个孔设为对照组，另外 个孔设为 （值）组，个孔都加入细胞悬液（含 个细胞 孔），然后将 孔板置于、的培养箱中培养。（）等 孔板内细胞密度达到 时，用 枪头在 孔板每孔内划出一道伤口，再小心吸去 孔板内细胞悬液，用 清洗干净每孔，然后阴性对照组加入用无血清培养基稀释的 每孔 ，组加入用无血清培养基稀释的 ，每孔。（）加完在倒置显微镜下拍划痕 （划痕即时）的照片，然后将板置于 、的培养箱蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期中继续培养，后再对板进行拍照，最后用 软件计算划痕前后细胞之间空白处面积差（单位：像
12、素），取平均值，计算迁移率。迁移率（划痕 空白处面积 划痕后 空白处面积）划痕 空白处面积。碘化丙啶染色检测细胞周期（）对数生长期细胞，胰酶消化后加入完全培养基终止消化，离心，弃上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀。取一块 孔板，其中 个孔设为对照组，另外 个孔设为 组，个孔都加入细胞悬液（含 个细胞 孔），然后将板置于 、的培养箱中培养 。（）后等细胞完全贴壁进行加药处理，即阴性对照组加入用完全培养基稀释的 每孔 ，组加入用完全培养基稀释的 每孔 ，加完将板置于、的培养箱中培养，后按照碧云天细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒操作说明处理细胞，用 流式细胞仪和 软件检测细胞周期分布情况。碘化丙啶双染检测
13、细胞凋亡 种板及加药步骤同上，加完药后将 孔板放入置于 、的培养箱中培养，后按照碧云天细胞凋亡检测试剂盒操作说明处理细胞，用 流式细胞仪和 软件检测细胞凋亡情况。统计学方法采用 检验、方差分析和 检验。结果 和 检查结果 （，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：，；（，）：；（）：，：；：；，；通过对上述数据解析，我们确定了 的化学式（），相对分子量（）。实验结果 和吉西他滨的抑制率都具有浓度依赖性，但相同浓度下 组的抑制率高于吉西他滨组，差异均有统计学意义（）（见表
14、）。组的 值明显低于吉西他滨组，分别为 和 （见表）。后续实验利用 这个浓度进一步验证 对 细胞的抗肿瘤活性。表 不同浓度 对 细胞的抑制率（；）分组抑制率 对照组（）（）（）（）（）组内 吉西他滨 对照组（）（）（）（）（）组内 检验：同组药物，与（）组比较 ，；与（）组比较，；与（）组比较 ，；与（）组比较 ，；与（）组比较 。与同浓度吉西他滨组比较 ，表 和吉西他滨作用 细胞 的（）分组 吉西他滨 形态学观察结果从 形态学观察来看，与 组和吉西他滨组相比，在 浓度时 细胞形态发生变化，细胞变小变圆；在 浓度时出现核碎裂，细胞死亡；随着 浓度的增加，细胞出现大面积死亡，大量核碎裂并从细胞膜
15、溢出。说明 具有更显著的细胞毒作用（见图）。划痕实验结果与对照组（）相比，处理组（）细胞迁移率较低（，），说明 处理组具有更强抑制 细胞迁移的作用（见图）。细胞周期检查结果 与对照组相比，处理后，期平均细胞比例略有上升，由 上升至 ，期平均细胞比例由 下降至 ，期平均细胞比例由 上升至，能使 细胞阻滞在 期（见表）。细胞凋亡检查结果与对照组（）相比，组（）细胞凋亡率更高（，）（见图）。表 对照组和 处理组在不同细胞周期的细胞分布比例（；）细胞周期对照组 处理组 期 期 期 组内 检验：与 期比较 ，；与 期比较 。与同期对照组比较 讨论 肝癌作为一种发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，已成为全球性
16、健康问题。化疗是目前肝癌的主要治疗手段之一，但相当一部分肝癌病人由于个体差异和耐药而不能达到理想的治疗效果。杨梅素蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期是一种具有广泛抗肿瘤活性的天然产物，但天然产物的水溶性和脂溶性较差，这限制了杨梅素类药物的开发及临床应用。是以杨梅素为母体合成的化合物，在结构设计上以多个甲氧基取代杨梅素结构式中的羟基，另外还加入哌啶、氟基和二硫代羧酸基团，其设计的意义在于：多甲氧基黄酮具有抗肿瘤作用并能增加化疗药的敏感性；哌啶环具有抗肿瘤作用并能增加药物的水溶性；氟基具有抗肿瘤作用并能提高药物的亲脂性、靶向性和生物利用度，促进药物代谢；二硫代羧酸基团也具有抗肿瘤活性。本研究中，我
17、们还通过一系列细胞实验初步验证了 的抗肿瘤活性和作用机制，结果表明 是一种抗肿瘤活性较强的浓度依赖性药物，随着浓度的增加其抑制率不断增加，在 浓度时，的抑制率高达 ，远高于吉西他滨 。为了进一步验证这种体外抗肿瘤活性作用机制，我们研究了 对人肝癌细胞 细胞周期的影响，结果表明 作用 细胞 后能使细胞周期阻滞在 期。有研究表明细胞周期发生阻滞后，随着阻滞时间的延长细胞就有可能进入程序性死亡即凋亡阶段，因此，我们利用流式细胞术进一步验证了 对 细胞的凋亡诱导作用，结果表明 能显著促进 细胞凋亡。为了更全面地探索 的体外抗肿瘤作用机制，我们还利用划痕实验验证了 对 细胞迁移的影响，结果表明目标化合物
18、作用细胞 与对照组相比，能显著抑制 细胞迁移（组迁移率为 ，对照组迁移率为，）。综上，作为新型杨梅素衍生物对人肝癌细胞 细胞具有显著的体外抗肿瘤活性，在结构上我们引入哌啶环以增加药物的水溶性，引入氟基以提高药物的亲脂性，是否比杨梅素具有更好的水溶性和脂溶性，我们将在未来的研究中进一步验证。可以通过细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡发挥抗体外肿瘤作用，且能够抑制细胞迁移。细胞的增殖、迁移、周期和凋亡既是相互独立，又是相互联系和制约的动态过程，增殖、迁移、周期任一环节的改变都会使细胞走向凋亡。如何影响细胞周期，如何诱导细胞凋亡？我们的猜想是：作为一种具有较强抗肿瘤活性的氮氧化合物，在作用 细胞时很可能会造
19、成细胞氧化应激和 或 损伤，一旦损伤，细胞就会通过 的调节诱导周期阻滞和凋亡维持自身基因遗传的稳定性。其具体作用机制可能为 损伤后，细胞启动修复系统，蛋白表达水平大大提高，蛋白表达增加会促进下游 蛋白的表达，蛋白表达增加会抑制细胞周期蛋白 和 的表达，从而将细胞周期阻滞在 期；而当细胞损伤到无法修复的程度时，则主要通过线粒体途径最终诱导细胞凋亡。因此，在后续的研究中我们将从蛋白和核酸水平对此作用机制进行进一步验证。参考文献 ，：（），（）：，（）：，：李兴媚，罗娜，关郁，等 卡铂联合杨梅素对人卵巢癌 细胞侵袭、转移及 通路的影响 中国计划生育和妇产科，（）：，（），（）：，：，：苏丽娟，付有荣
20、，田莉，等 杨梅素通过上调 的表达抑制 细胞迁移 临床和实验医学杂志，（）：，（）：，（），（）：李吉顺，吴红林，朱子豪，等 杨梅素衍生物的合成及抗氧化活性研究 中国药物化学杂志，（）：，周万飞，刘高峰，秦中强，等 对肝细胞癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响 蚌埠医学院学报，（）：李红梅，李静，霍强，等 新型格尔德霉素葡萄糖苷的制备及其诱导人乳腺癌 细胞凋亡的作用 蚌埠医学院学报，（）：，（）：谷悦 大红袍红橘多甲氧基黄酮提取物及其主要单体的抗前列腺癌活性研究 重庆：西南大学，寇丽栋，王伟 四氢咪唑并，：，噻吩并，哌啶衍生物的合成及抗肿瘤活性 应用化学，（）：赵方诺 氟原子在药物设计中的主要应用以及
21、引入方法国际公关，（）：，（）：郝莹莹，于佳斌，练旭冬，等 紫草素衍生物诱导肺癌细胞 细胞周期阻滞及细胞凋亡 山东化工，（）：冉茂良，高环，尹杰，等 氧化应激与 损伤 动物营养学报，（）：苏明俊 蛋白通过 信号通路介导宿主细胞 期阻滞的分子机制 大庆：黑龙江八一农垦大学，李朝兴 调控 依赖的信号通路及细胞凋亡武汉：湖北工业大学，（本文编辑 刘梦楠）（上接第 页），（）：中国医师协会血液科医师分会，中华医学会血液学分会，中国医师协会多发性骨髓瘤专业委员会 中国多发性骨髓瘤诊治指南（年修订）中华内科杂志，（）：，（）：，（）：王显凤，周慧星，张之尧，等 骨髓标本放置时间对流式细胞术浆细胞免疫表型检测结果的影响 白血病淋巴瘤，（）：张先瑞，方美云 与 多发性骨髓瘤细胞生物学特征的研究现状 东南大学学报（医学版），（）：，（）：，：徐家新，李娟，王磊，等 失衡与毛细支气管炎发病关系研究 蚌埠医学院学报，（）：傅磊，沈磊，卞建军，等 重组人血小板生成素联合大剂量地塞米松对原发性 病人 细胞及、细胞的影响 蚌埠医学院学报，（）：时杰，朱尊民，孙恺，等 在初诊多发性骨髓瘤患者的表达及预后判断中的意义 中华血液学杂志，（）：，（）：（本文编辑 周洋）蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期
