1、论著血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤临床与分子病理学特征分析时云飞王豪杰刘卫平米 岚龙孟平刘雁飞赖玉梅周立新刁新婷李向红(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所.病理科.中心实验室.淋巴瘤科恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室北京)摘 要 目的:分析血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤()病理学特征、基因改变及预后的影响因素 方法:选择北京大学肿瘤医院病理科 年 月至 年 月明确诊断且有完整随访信息的 患者病例资料进行回顾性分析对病例进行形态学分型型:淋巴结反应性增生()样型:边缘区淋巴瘤()样型:外周 细胞淋巴瘤非特指型()样 结合免疫组化染色评估肿瘤有无滤泡辅助 细胞()表型生发中心()外滤泡树
2、突细胞()增生 和 ()样细胞及大(细胞淋巴瘤)转化计数每个高倍视野()病毒()阳性细胞含量按需要完善 细胞受体()/免疫球蛋白()基因重排检测和靶向外显子二代测序()检测 结果:共收集患者 例形态分型型 例(.)、型 例(.)、型 例(.)例(.)具有明确 表型有不同程度 外 网架增生(中位.)例(.)有 样细胞 例(.)有大 转化.(/)的病例属于 高含量(个/)/重排分析./(/)./(/)./(/)./(/)检测 突变.(/)突变.(/)突变.(/)突变.(/)检测 例患者分为()和 共突变组(例):型 例型 例具典型 表型未见 细胞和大 转化()单 突变组(例):型 例型 例型 例不
3、具典型 表型 例伴 细胞 例伴大 转化 例/例/例/例()仅 和/或 突变组(例):型 例型 例均具典型 表型伴 细胞 例伴大 转化 例()无突变组(例)均为型 表型典型 网架增生/例 单因素生存分析证实 阳性细胞含量高为总生存和无进展生存的不良预后因素(.及 .)结论:组织病理学难以诊断主要见于形态型伴 样细胞大 转化此时/重排检测对诊断有帮助但价值有限 增加 检测、等基因突变可有效辅助 疑难病例的组织病理学诊断 肿瘤组织中 阳性细胞含量升高提示预后不良关键词 细胞淋巴瘤病理学基因突变预后中图分类号.文献标志码 文章编号():./.().网络出版时间:网络出版地址:/./.:().:.()(
4、)().北京大学学报(医学版)().()()()().()()()./(/)().:():.(/).(/).(/).(/).(.).(/).(/).(/).(/)/.(/)/.(/)/.(/)/.(/).(/).(/).(/).:()():()():./()/():()()./.()()(.).:./.血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤()来源于滤泡辅助性 细胞()在所有外周 细胞淋巴瘤()中占 最新报道甚至高达.多为侵袭性病程好发于老年患者分期晚预后差并常伴有全身淋巴结肿大、皮肤瘙痒以及免疫学改变 部分 初期淋巴结反复肿大误认为良性淋巴结肿大导致延误诊断 确诊依靠组织病理学诊断但经常与淋巴组织反应
5、性增生()、边缘区淋巴瘤()、经典型霍奇金淋巴瘤()、单纯弥漫性大 细胞淋巴瘤()、外周 细胞淋巴瘤非特殊型()等混淆容易发生误诊严重影响了 的精准治疗加做基于 方案的 细胞受体()和免疫球蛋白()基因重排及克隆性分析有助于 的诊断 此外高通量二代测序()技 术 证 实 存 在 着 热 点 突 变(如、等)和常见表观调控相关的突变(如、等)这些突变被认为对于辅助 的诊断具有价值 尽管国内对 上述基因改变已有较大样本的报道 但检测均基于一代测序技术发生频率等与国外报道存在较大差异尚待深入研究 此外在中国人 预后因素研究中存在不一致性 病理指标的预后价值仅讨论总生存()未纳入临床指标进行分析诊断价
6、值有限 本研究选择北京大学肿瘤医院病理科 年 月至 年 月明确诊断且有完整的随访信息的 患者 例进行回顾性分析探讨 组织病理学诊断、分子检测及其影响预后的指标 资料与方法.病例资料选择 年 月至 年 月北京大学肿瘤医院病理科诊断的 患者共 例要求病例有临床病理及生存资料用于回顾性分析 本研究开始前已经北京大学肿瘤医院伦理委员会审查批准(批件号:)经 位血液病理学专家核实诊断参照 版造血和淋巴组织肿瘤分类北京大学学报(医学版)().进行形态学分型(以上区域)型:淋巴结反应性增生()样结构大致正常 细胞区增生不显著伴有滤泡增生型:边缘区淋巴瘤()样正常结构部分存在 区增生与边缘区融合类似型:外周
7、细胞淋巴瘤非特指型()样正常结构完全破坏肿瘤弥漫增生类似.免疫组织化学染色及原位杂交石蜡包埋组织切片厚 应用 免疫组织化学自动染色机(公司美国)完成 显色使用的一抗见表 阳性对照为反应性增生的淋巴组织阴性对照均为一抗稀释液代替一抗进行染色表 免疫组化使用的一抗 .判读标准:仅记录明确着色的肿瘤细胞占比明确着色定义是指正确的着色部位出现中等以上强度着色(棕色或褐色)使用、作为 标志物要求 肿瘤细胞(使用 及 作为参照)有明确着色时方可判断为阳性肿瘤细胞 表型判定标准为任意三个以上的 标志物阳性或至少 和 同时阳性为典型的 表型使用 计数滤泡外增生 细胞占肿瘤总面积的百分比()通过 染色显示 细胞
8、的增生情况及有无大 转化(弥漫区)可能除免疫母细胞固有表达 外如 肿瘤细胞(联合 作为参照)有明确 着色判为肿瘤细胞阳性.病毒编码的 ()原位杂交检测按照 原位杂交试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行操作 判读标准:在 倍高倍镜()记录明确着色的肿瘤细胞数目明确着色定义是指细胞核出现中等以上强度着色(棕色或褐色)由于 阳性细胞呈现散在和灶性两种模式:散在分布者共计数 个典型的高倍视野取绝对平均值(个数/)对于灶性分布者计数灶性分布区的阳性细胞均值(阳性数目/高倍视野)以及灶性区面积在肿瘤总面积中的占比()两者相乘换算为相对平均值(阳性数目/高倍视野)依据绝对/相对平均值将肿瘤组织中
9、 阳性细胞为高含量组(个/高倍视野)以及低含量组(个/高倍视野)./基因重排检测收集待检测样本石蜡切片(厚 张)标准化首先刮取石蜡切片样本脱蜡后用 试剂盒(德国)提取检测 浓度与纯度(美国)采用基因重排试剂盒(上海睿昂)检测 产物片段 扩增法进行 和 检测 条件为 预变性 后 、共个循环最后 延伸 所有反应体系均设立阳性对照和空白对照 取 扩增产物使用 基因分析仪及相应试剂盒推荐步骤进行 片段分析(美国)及结果判断/重排检测存在单克隆性重排(阳性/)或无单克隆性重排(阴性/)时云飞等 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤临床与分子病理学特征分析.靶向外显子测序()使 用 样 品 专 用 提 取 试 剂
10、 盒(美国)分离提取 对 进行定性定量检测(美国)使用 试剂盒进行 酶切(左右)末端修复、接头连接及预 完成预文库构建 预文库进行杂交捕获(包含 个血液恶性肿瘤相关突变 美国)富集目标 片段进行扩增以生成文库 在 测序系统(美国)上进行 文库高通量测序(平均测序深度约 )使用(.版)进行参考基因组比对 软件检测单核苷酸变异()和小片段插入缺失 浏览器人工审核所有候选变异.统计学分析应用 .软件计量资料以 表示组间比较采用 检验计数资料组间比较采用 检验两种影响因素的独立性检验应用四格表独立性检验 例 均有完整的随访信息总生存定义为从确立诊断直至死亡或者存活患者最后一次随访所经历的时间无进展生存
11、()定义为患者从确立诊断直至疾病出现进展、复发、死亡的日期或无上述事件的最后一次随访日期间所经历的时间 截止随访结束单因素生存分析应用 法(统计比较采用 法)由于纳入生存分析的病例较少未行进一步多因素生存分析 岁)患者有 例(.)男性 例(.)例(.)有 型症状 例(.)有骨髓受累 分期晚期(期)例(.)评分高危组(分)例(.)()评分 的患者 例(.)除 例患者口服泼尼松单药治疗外其余 名患者接受 个周期(中位数为 个)化疗总完全缓解()率.截止 年 月入组 例患者随访时间.个月中位随访时间为.个月 例(.)出 现 死 亡 事 件 例(.)出现进展、复发、死亡等事件 时间为.个月中位 时间为
12、.个月 年预计 率.时间为.个月中位 时间为.个月 年预计 率.(表)表 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤的主要临床病理特征 ()()(.)(.)(.)(.)(.)()(.)()(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)()(.)/(.)(.)./.形态学及免疫表型特征及 病毒感染分析 例中均可见不同程度的淋巴结结构破坏形北京大学学报(医学版)().态学分型型 例(.)型 例(.)型 例(.图)所有病例增生的肿瘤细胞绝大多数体积小中等大胞浆中等量、透明或淡染细胞核轻度异型性部分细胞可见核仁形成肿瘤细胞丰富区域可见显
13、著增生的高内皮微静脉所有病例肿瘤细胞均阳性表达 及 标志物中 阳性率.(/)阳性率.(/)阳性率.(/)的阳性率.(/图)综合评估 例(.)具有典型 表型 例(.)无 表型剩余 例 标记物不全通过综合其他病理学改变得以确诊 染色证实生发中心外滤泡树突细胞不规则灶性增生经评估增生网架涵盖的肿瘤面积占比 (中位.)其中 例增生活跃()例(.)形态学伴有数量不等 免疫母细胞体积明显增大类似 样细胞有 例在病程中合并或者最终进展为 (所谓大 转化 图)通过对 检测阳性细胞的计数 计数 .个阳性细胞/(中位数.).(/)的病例属于 高含量组其余为低含量(图)肿瘤细胞 增殖指数为 (中位).(/)的患者
14、(表)此外免疫母细胞和 样细胞均表述 而肿瘤细胞 阳性为.(/).肿瘤的分子病理学特征按诊断需要 例行 重排检测阳性 例(.)例行 重排检测阳性 例()例/重排检测同时进行 例(.)为典型/其余 例不典型 例/(.)例(.)/例(.)/例行 检测 例(.)至少有一个以上的突变 突变 例(.)突变 例均同时发生 突变但仅有 例合并了 突变 而 突变的 例中 例有 突变除 例合并 突变外 例有 突变.病理形态学、免疫表型与分子病理改变相关性分析整合 例 检测病例形态学、免疫表型及分子检测 可 分 组:()和 共 突 变 组(例):生长方式 例为 型 例为型所有病例都有典型 表型未见 样细胞和大 转
15、化病例()单 突变亚组(例):生长方式相对复杂(型 例 型 例 型 例)例不具 表型 例 网架增生不显著 例伴有 样细胞 例伴有大 转化重排检异常模式 例/例/()仅 和/或 突变组(例):例为型生长方式 例为 型生长方式所有病例均具有 表型 例伴有 样细胞 例伴有大 转化()无突变组(例):这些病例均有典型的 病理特征生长方式型未见 样细胞和大 转化伴有典型的 表型和显著的 网架 例/检测未见突变(图):/)()().图 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤典型的形态学类型 ().图 典型 病例的、和 表达情况 时云飞等 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤临床与分子病理学特征分析 ()()().图 典型血
16、管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤病例的滤泡外滤泡树突细胞网架、样细胞和伴大 转化病例的形态特征 ().的临床病理预后相关因素分析临床指标单因素分析显示受累淋巴结区域数()及血清 水平升高、未行移植 显著变差(依次为.及.)其他指标对 无显著影响(均 .)受累淋巴结区域数()及血清 水平升高、未行移植是 的不 良 预 后 指 标(依 次 为.、.和.)而其他指标 差异无统计学意义(均.)病理学指标单因素分析发现 差异即 阳性细胞高含量 显著变差(.图)阳性细胞高含量是 显著的不良预后指标(.图)对经 检测的 病例()进行单因素生存分析发现有 突变的 显著好于无突变者(.图)而 突 变(.)、突变(.)
17、和 突变(.)不能提示预后存在 差异即 突变病例的 显著延长(.图)而 突变(.)、突变(.)、突变(.)的 差异无统计学意义(表)讨论本研究 大部分具有典型的 的形态学特征 推荐的 相关的较为特异标志物、和 应尽量全面检查有 例因为标志物不全而无法确定 表型需再结合其他形态学及免疫表型特征得以诊断 组织病理学诊断中经常出现误诊分析原因主要有:()型局限于滤泡间生长并可保留边缘窦且免疫表型可缺乏 中 细胞表型丢失现象经常被误以为良性反应性增生()可伴滤泡间 细胞异常增生类似边缘区淋巴瘤而误诊()中 免疫母细胞可明显增大类似霍奇金淋巴瘤中的 细胞而误诊为()如果 中增生的 细胞进展为侵袭性 细胞
18、淋巴瘤(即所谓 伴有大 转化)此时容易误诊为弥漫大 细胞淋巴瘤 由于 明确诊断的关键是增生的 细胞是否为肿瘤细胞/重排检出北京大学学报(医学版)()./有助于诊断 但 病例/由此推测至少/仍会出现组织病理学诊断困难导致临床医生无法制定最佳治疗方案 本研究病例中部分病例进行了/检测有 /的病例出现了不典型 表 现 多 数(/)为/少 数 为/(/)甚至/(/)不能辅助诊断 ().图 例 病例的临床、组织病理学和分子改变整合图 ()(/)()(/)().().图 生存分析显示 肿瘤组织中 病毒含量()、和 突变()与预后相关 ()()时云飞等 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤临床与分子病理学特征分析表
19、 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤的预后因素分析()()()()().(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).().(.).(.).(.).(.).().(.).(.).().(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).(.).目前认为 在基因水平也有独特的分子亚型 肿瘤性 细胞存在 基因突变(发生率)、突变(发生率 )、突变(发生率为 )以及 突变(发生率 )也常看到 通路相关的基因异常(、和 等发生率 个/)者预后显著变差并且是除移植之外的 和 的独立预后指标 尽管国外有相反的报道认为 阴性者预后更差但是文献计数的是阳性细胞占所有细胞的百分比
20、并且北京大学学报(医学版)().仅局限于相对年轻(岁)的 患者 国内有较小样本()的类似研究证实组织 表达提示预后差更支持本研究结论 我国有学者发现血清 病毒 含量高的患者预后差韩国也有类似报道但均未对组织 含量进行定量分析 本研究发现除 含量外 突变和 突变可能有一定预后价值但病例数过少综上所述 是一个独特的淋巴瘤类型典型的形态学、免疫表型是诊断 的基础对于出现了 样细胞大 转化或者早期的 病例同时应用/重排检测对诊断有一定帮助但约/病例可能会出现不典型甚至矛盾的结果仍然存在诊断困难 基于 技术检出、等基因突变可有效辅助 的组织病理学鉴别诊断 的准确诊断分型有赖于整合临床表现、组织病理学特点
21、、/基因重排及 检测结果 肿瘤组织中的 阳性细胞含量升高是独立的不良预后指标参考文献 .():.:.():.:.():./.():.():.郭艳敏 刘雪霏 焦莉娟 等.血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤组织学分级与预后分析.中华病理学杂志 ():.:.():.():.李婷婷 罗璐婷 陈溢 等.例血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤的临床特征及预后:单中心分析.中华血液学杂志():.().():./.():.():.():.():.():.():.():.中国临床肿瘤学会肿瘤标志物专家委员会 中国肿瘤驱动基因分析联盟.二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识.中华医学杂志 ():.中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会 中华医学会血液学分会中华医学会病理学分会.二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(年版).中华血液学杂志 ():.():.张晨 王小沛 郑文 等.血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤例临床分析.中华医学杂志 ():.():.王芳 张瑰红 丁凯阳 等.、和 在血管免疫母 细胞淋巴瘤中的表达及其临床病理学意义.中国实验血液学杂志 ():.():.:.(收稿)(本文编辑:王 蕾)时云飞等 血管免疫母细胞性 细胞淋巴瘤临床与分子病理学特征分析
