1、书书书第 卷第 期烟台大学学报（自然科学与工程版）年 月 （）文章编号：（）：收稿日期：基金项目：内蒙古自治区关键技术攻关计划（）；国家科技条件基础平台国家基础学科公共科学数据中心课题（）。通信作者：唐永政（），副教授，硕士，主要研究方向为海洋藻类生理。不同基因型颗石藻（）对海洋酸化及高光耦合的生理响应林燕妮，王寅初，任庆敏，唐永政（烟台大学海洋学院，山东 烟台 ；中国科学院烟台海岸带研究所，山东 烟台 ；国家基础学科公共科学数据中心 北京 ；中国科学院海洋大科学研究中心，山东 青岛 ）摘要：为探究不同基因型的颗石藻（）和 在酸化条件下及短期高光下的生理响应，设置两种二氧化碳分压（、），强光条
2、件为 ，比较两者生理参数的差异。结果表明，酸化条件下颗石藻的生长率及细胞粒径均下降。高 （）条件对 和 的钙化作用影响不同，的颗粒无机碳（）含量、产率均降低，表明其钙化作用被抑制，相反 的 含量产率均上升表明钙化作用被促进。酸化条件导致细胞的饱和光强、表观光合效率及最大电子传递速率均降低，但细胞通过增加光合色素含量提高光捕获能力。在高 （）条件及高光胁迫下，细胞非光化学淬灭、有效光化学效率、的修复速率均下降，的损伤速率则上升，但与 相比，钙化较弱的 受高光的胁迫更强。以上结果表明不同基因型的颗石藻对酸化条件的响应不同，酸化条件会加剧高光胁迫。关键词：颗石藻；海洋酸化；高光；生理响应中图分类号：
3、文献标志码：颗石藻（）为具有钙质外壳的单细胞海洋浮游植物，属于定鞭藻门（），定鞭藻纲（）。作为海洋中钙化生产力最高的浮游植物类群，颗石藻的年碳酸钙产量为海洋年碳酸钙总产量的三分之一，远洋沉积物中的碳酸钙约有一半是由颗石藻生产沉降 。颗石藻是海洋初级生产力的重要贡献者，通常占初级生产力 的 到 ，在 形 成 季 节 性 水 华 时 占 。颗石藻在生长过程中通过光合作用捕获二氧化碳，并在钙化作用中释放二氧化碳，两者对二氧化碳捕获和释放的差异是模拟海洋碳循环的重要因素 ，因此，颗石藻在生物地球化学循环和气候调节方面扮演重要角色 。是分布最广的颗石藻物种，也是海洋碳循环研究中的“模式生物”。随着人类生
4、产活动对化石燃料消耗增加，大量 释放到大气中对全球气候及环境造成一系列问题，包括海洋酸化、全球变暖等。进而对海洋生态系统产生严重危害，影响海洋浮游植物的生长 。全球变暖会导致海洋上层混合层变浅，使生活在海洋混合层中上部分的颗石藻暴露在高光的海洋环境中 ，导致颗石藻会受到海洋酸化和更强光照辐照 ，不同环境因素的耦合对颗石藻的影响也会有差异。烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷颗石藻如何应对环境的变化受到众多关注。有研究表明颗石藻钙化作用产生的颗石粒钙质外壳可以保护藻细胞避免受光损伤 ，颗石粒对光照辐射起遮蔽作用，保护细胞耐受强光胁迫，使紫外辐射（）和有效光辐射（）的透过效率降低 。对不同种类
5、的钙化有着不同影响，有促进、抑制及无变化，有研究指出这种差别是由于遗传基础不同导致的种间差异所致 。蔡小霞等 对 在不同浓度 下的钙化作用进行了研究，发现 增加到一定浓度时能促进钙化作用，但浓度过高则抑制生长、钙化停止。不同种颗石藻钙化的响应程度不同，甚至同种的不同株系之间表现也有区别：随着二氧化碳浓度 （）增加，和 的钙化被抑制 。当 （）从 增加到 时，的钙化对 （）上升的响应很微弱，其钙化速率呈现非线性变化，当 （）高于或低于现今水平时，其钙化作用都减弱 。因此研究海洋酸化对颗石藻钙化作用时具有种间特异性。等研究表明 分为 与 两个清晰的进化枝 ，两者之间有较为显著的生理与形态差异。本研
6、究采用 两种不同基因型 采集自秘鲁上升流同一海域的藻株 和 。经进化分析表明，和 分别属于 、进化支，两者有遗传可比性，且经电镜观察发现 具有较厚的钙质外壳而 的外壳较薄。本研究考虑了两株颗石藻在不同 （）下的生理响应及酸化条件下对短期高光胁迫的响应。实验材料与方法 实验藻种及培养条件实验所用的钙化颗石藻 和 由法国欧洲环境地球科学教育研究中心 教授提供。经系统发育分析证明，和 分别属于 的 进化支与 进化支 。实验藻株的培养光照为 ，培养温度为 ，光暗周期设置为 。本实验 （）设置两种：（低）和 （高），其中 是实验室目前空气中二氧化碳的分压，是预测至 世纪末大气中二氧化碳的浓度 ，通过在二
7、氧化碳光照培养箱（，跃进医疗，中国上海）中控制纯二氧化碳与空气混合获得。培养基使用前，在相应二氧化碳分压下预先平衡。首先进行细胞驯化，在相应 （）下培养实验藻株，当细胞浓度达到 个 后，再次进行驯化，使实验藻株适应相应的实验条件。接种起始密度为 个 ，当细胞浓度达到 个 以上时，将驯化适应实验条件后状态良好的藻株，转接到 的透气盖细胞培养瓶中进行正式实验，两藻株各设置三个平行。正式实验培养周期 后（约 代），细胞密度达到 个 时收样，并测定藻细胞对短期高强度光照（）的响应。培养液碳酸盐系统参数测定 值的测定：使用 计（上海雷磁）测定。碱度（）的测定：使用总碱测试仪测定。使用 系统 ，由已知的盐
8、度、温度、值和碱度计算碳酸系统的其他参数（、）。碳酸钙饱和度 的计算公式如下：，式中，为碳酸钙解离常数，单位为 。细胞生长率及粒径测定藻细胞密度为 个 时收样，计算生长率，公式如下：（）（），式中，为生长率，为 时的细胞浓度，为 时的细胞浓度。收样后对藻液进行稀释，由流式细胞摄像系统 进行藻细胞粒径测量。颗粒无机碳（）和颗粒有机碳（）的含量测定将 的玻璃纤维膜进行预处理，经锡纸包裹后在马弗炉中 燃烧 以上，以除去滤膜上的碳。收藻时将 藻液过滤收集到膜上，滤膜冷冻保存。用于测 的玻璃纤维滤膜提前浓盐酸酸熏过夜，以除去膜上无机碳。将滤膜于 烘干 之后，锡纸包裹制样并在元素分析仪中进行 和 含量测定
9、。将细胞中 和 含量与生长率（）相乘，计算 和 的生产速率：产率 含量 ，产率 含量 。细胞外壳的结构观察用 聚碳酸酯滤膜（孔径）抽滤 藻液，过滤前摇匀使藻细胞在膜上均匀分布，将收集第 期林燕妮，等：不同基因型颗石藻（）对海洋酸化及高光耦合的生理响应到的细胞在烘箱 干燥 ，使用扫描电子显微镜（）拍照观察。细胞色素含量测定细胞色素使用 甲醇 黑暗条件下过夜进行提取。将浸取液使用扫描分光光度计进行 波长下扫描，用以下公式计算类胡萝卜素 、叶绿素 和叶绿素 的含量（）：（叶绿素 ）（）（），（叶绿素 ）（）（），（类胡萝卜素 （）（）。叶绿素荧光参数测定最后一天收样时，使用叶绿素荧光仪（，捷克 ）对
10、颗石藻细胞的叶绿素荧光进行测定。测量获得最大光化学效率（）及在、和 时有效光化学效率（）和非光化学淬灭（），并通过 拟合计算光系统（）的损伤 修复速率来反映细胞对短期高光胁迫的响应。快速光响应曲线设置 个光强梯度（光合有效辐射 分别为 ，），每个光强时长为 ，计算相对电子传递速率（）：，其中，常数 表示细胞吸收的光能的 传递到光系统（）。表观光合效率（）、饱和光强（）及最大相对电子传递速率（）通过 将 数据回归拟合得到。光系统的修复速率 （）及短期高光胁迫处理时光系统的修复速率 （）的计算公式如下 ：（），（）。其中 和 表示 在时间 和 时的值。统计分析实验数据通过软件 进行分析，数值以平均
11、数 标准差（珋 ）来表示，不同处理间的差异比较通过方差分析进行。不同基因型的藻株及不同 （）处理间差异采用 检验进行分析。将 作为组间差异有统计学意义的标准。结果 碳酸盐系统参数通过不同 （）条件模拟海洋酸化，测定不同（）下初始培养基碳酸盐系统参数，主要为溶解无机碳（）、总碱度（）、（表）。碳酸盐浓度和 是颗石藻钙化作用对海洋酸化响应的重要参数，的数值主要取决于海水碳酸盐的浓度，当 时，可形成碳酸钙 ，。在高 （）条件下培养基 （）明显下降，培养基的 下降到 。本实验严格控制细胞密度，以维持碳酸盐系统恒定。表 初始培养基碳酸盐系统参数 （）参数 （）（）（）（）（）（）低 高 细胞生长率及粒径
12、在高 （）条件下，和 生长率均下降，但相同 （）条件下 的生长率高于 且差异具有统计学意义（图 （）。细胞平均粒径均显著大于 。与低 （）相比，在高 （）条件下 和 的细胞粒径均显著减小（）（图（）。细胞粒径较大，可能是其钙化能力较强，产生较厚的碳酸钙外壳，增大了细胞尺寸。细胞较小，可能是因为其具有较高的生长的速率，在胁迫条件下将更多的能量用于增殖。烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷 LH0.00.20.40.60.81.0 PERU41 PERU46AbBbAaBa01 01234AaAaBbBb PERU41 PERU460Aa?不同小写字母表示相同 （）下不同藻株间差异有统计学意义（
13、）；不同大写字母表示相同藻株在不同 （）下差异有统计学意义（）。图 高 （）与低 （）下颗石藻的细胞生长率和粒径 （）和 的含量及产率如表所示，与 中的 含量组间差异有统计学意义（）。尤其是在高（）时，细胞内 含量有显著提高（），而 细胞内的 含量降低，说明酸化条件下 的钙化作用显著降低。随着（）增加，藻株的 含量和产率均有所减少。的 含量及产率均显著高于 （），细胞内 含量高与 高生长速率相符。在 （）较高时，会导致颗石藻的生长速率下降及颗石藻细胞内的 含量升高。在本实验中，的 比值随着 （）的增加而增加，但 的 比值随着 （）的增加而减少，的变化规律与前人试验研究的规律相同 。表 酸化条件
14、下 和 的含量及产率 藻株（）含量（细胞）含量（细胞）产率（细胞 ）产率（细胞 ）低 高 低 高 注：不同小写字母表示相同 （）下不同藻株间差异有统计学意义（）；不同大写字母表示相同藻株在不同 （）下差异有统计学意义（）。细胞外壳的钙化情况由电镜观察结果（图 、）可见，在高 （）条件下，藻株的颗石粒大多会产生畸形状况，同时也有正常钙化的颗石粒。在高 （）条件下观察到较多的畸形颗石粒，颗石粒的总体完整程度较 更好。在不同的（）下都有完整的颗石粒，低 （）条件下，电镜观察到破损的颗石粒多，而在较高 （）培养条件下仍能发现较多的完整的颗石粒。据此推测，颗石藻 适应酸性环境，高 （）对其生物钙化作用没
15、有产生明显的抑制作用。细胞色素含量与低 （）相比，在高 （）下两藻株细胞的光合色素含量均有所增加，细胞的叶绿素 及类胡萝卜素含量显著增加（），分别增加了 、，胞的叶绿素 含量增加显著（），增加了 （图 ）。第 期林燕妮，等：不同基因型颗石藻（）对海洋酸化及高光耦合的生理响应?图 不同 （）条件下颗石藻 细胞形态及颗石粒状态 （）?图 不同 （）条件下颗石藻 细胞形态及颗石粒状态 （）烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷 0.000.020.040.060.080.100.12 PERU41 PERU46ABBA00.1?0.00.10.20.3 PERU41 PERU46AAAA0?0.00
16、.10.20.30.40.5 PERU41 PERU46ABAA0?不同大写字母表示相同藻株在不同 （）下差异有统计学意义（）。图 高 （）与低 （）下颗石藻细胞的光合色素含量 ，（）基于叶绿素荧光的光合生理变化如图 所示，两种 （）对 与 细胞的 无显著影响（），两株藻细胞间的 差异无统计学意义（）。0.00.10.20.30.40.50.60.7Fv/Fm PERU41 PERU46AaAaAaAa0?不同小写字母表示相同 （）下不同藻株间差异有统计学意义（），不同大写字母表示相同藻株在不同 （）下差异有统计学意义（）。图 不同 （）条件下颗石藻的 （）在低 （）条件下，两藻株之间的表观光
17、合效率 差异无统计学意义，的最大电子传递速率 显著低于 （），在高（）条件下，两藻株之间的 和 差异均无统计学意义（），但 的饱和光强显著高于 （）。与低 （）相比，高 （）条件下 和 的、和 均显著下降（），分别下降 、，分别下降 、（表 ）。对高光的短期光化学响应低 （）条件下适应后，和 的有效光化合效率 在 的高光处理中具有相同的变化趋势，先显著下降 后趋于稳定。正常培养光照下的两藻株具有最高的 ，高光胁迫下 均显著降低（图 （），其抑制率为 左右，结果表明高光处理对颗石藻细胞的光合作用具有负面影响。在高光条件下，两藻株的 变化趋势与 相反（图 （），表明藻细胞在高光条件下受到胁迫。短期
18、高光处理后，与低 （）第 期林燕妮，等：不同基因型颗石藻（）对海洋酸化及高光耦合的生理响应条件相比，高 （）条件下的 的 显著下降，而 细胞则无显著差异（图 （）。高 （）条件下适应后，及 的 在高光处理下有所上升但差异无统计学意义。高 （）短期高光处理下 的 更高（图 （），其通过增强 耗散多余光能来应对高光胁迫，表明钙化较弱的藻株更容易受高光胁迫。表 高 （）与低 （）下的电子传递链参数 、（）（）（）藻株 低 高 注：不同小写字母表示相同 （）下不同藻株间差异有统计学意义（），不同大写字母表示相同藻株在不同 （）下差异有统计学意义（）。?图 不同 （）下颗石藻的?图 不同 （）颗石藻的
19、（）烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷 在高光下 的损伤及修复速率相同 （）条件下，及 的修复速率在正常光照下的修复速率均高于高光条件的修复速率，组间差异有统计学意义（），两藻株之间的修复速率在相同光照处理下差异无统计学意义（）。与低 （）相比，高 （）条件下适应的 细胞在正常光照及高光下 的修复速率均下降，但 细胞 的修复速率均上升（图 （）。低 （）适应下高光处理导致两藻株 的损伤速率均显著升高（）。高 （）条件下，两藻株 的损伤速率在正常光照及高光处理下的差异均无统计学意义（）。相比于低（）条件，高 （）条件下细胞 的损伤速率上升（图 （）。在正常光照低 （）条件下生长的细胞其修复
20、损伤比值均大于，说明 修复速率大于损伤速率。高光处理下两藻株 的修复 损伤比值显著下降。与低 （）条件相比，高 （）条件下的 的 修复 损伤比值显著下降约 （），且 的修复 损伤比值显著高于 （）（图 （）。?不同小写字母表示相同 （）下不同藻株间差异有统计学意义（）；不同大写字母表示相同藻株在不同 （）下差异有统计学意义（）；表示正常光照和高光处理组间差异有统计学意义（）。图 不同 （）下正常光照和高光处理颗石藻的修复速率、损伤速率及两者比值 ，（）讨论 酸化条件下细胞的生理响应本实验探究 两种不同基因型的藻株 和 在不同 （）下的生理响应第 期林燕妮，等：不同基因型颗石藻（）对海洋酸化及高
21、光耦合的生理响应差异。扫描电镜下观察细胞形态及颗石粒形态发现 和 的钙化存在差异，的钙化作用更强，酸化对其钙化具有促进作用，而 的钙化作用较弱，酸化条件会抑制其钙化作用。高 （）条件下，的生长率及 的含量和产率均显著高于 ，这表明两株基因型不同的颗石藻对海洋酸化的响应方式不同，具有更强的钙化作用可以抵御海洋酸化的负面影响，而 通过强的增殖能力来抵御海洋酸化。酸化条件导致颗石藻细胞的饱和光强、表观光合效率及最大电子传递速率均降低，表明酸化条件抑制细胞的光合作用效率。高 （）下 细胞的叶绿素 及类胡萝卜素含量显著增加，分别增加了 、。这可能是 细胞受到更强的氢离子胁迫，细胞通过增加光合色素的含量来
22、增强捕光能力获得更多能量来抵御高 （）下的氢离子胁迫。与 相比具有更高的电子传递效率，表明 对光能的利用更为高效，这与 相对较低的生长率不相符。这种情况表明，更强的钙化作用消耗了大量的能量，而 的钙化相对较弱将光能更多的用于增殖。大量研究表明，海洋酸化对颗石藻生长及钙化作用既有积极作用也有消极作用 。积极作用体现为可以增加海水中的二氧化碳及碳酸氢根离子等光合作用底物，增强海洋浮游植物的光合作用，从而对其生长具有正面影响。消极的酸化效应则会增加海水中氢离子的浓度，影响细胞膜的氧化还原及通透性，并 影 响 胞 内 和 蛋 白 质 氨 基 酸 的 平衡 、降低 的光合作用效率 。等的研究发现特定海洋
23、酸化条件（的 浓度）对颗石藻的生长具有促进作用 ，这与本实验的结论一致。本实验中，高 （）条件下细胞的生长速率虽略有下降，但 生产速率相比于低 （）条件升高，说明酸化对颗石藻 的正面效应相对于的负面效应更加显著。生长速率在两种二氧化碳浓度下均高于 ，说明 通过增强增殖能力来适应海洋酸化条件。的比值及电镜下形态观察均表明 的钙化能力更强。在高 （）条件下，细胞的 含量及产率降低说明酸化条件下 钙化作用受到了抑制，与前人的研究海洋酸化会导致颗石藻钙化作用下降相符 。生物所同化的能量只用于生长和繁殖，不同生物的能量分配不同就形成不同的对策：选择 对策的生物分配更多能量用于繁殖，而选择 对策的生物则分
24、配更多能量用于个体生长 。结合这两种不同基因型藻株以上生理参数以及生长速率的监测，推测 和 在应对酸化胁迫时分别采用了 对策与 对策，前者分配更多能量用于快速繁殖，而后者则保守地分配更多能量用于保护性的外壳加固。不同（）及高光条件下细胞光合生理响应本实验探究 两种不同基因型的藻株 和 在适应不同 （）后进行短期高光胁迫，研究颗石藻对海洋酸化及高光耦合条件下的光合生理响应。细胞在受到光胁迫时会通过提高 耗散光合色素捕获的过剩能量以达到保护目的 。在低 （）短期的高光胁迫处理下，钙化较弱的 比钙化作用较强的 具有更高的非光化学淬灭能力，说明 受到更强的高光胁迫。有研究表明 的颗石粒对不同光质的光都
25、具有遮挡作用，可以阻挡 的可见光及 的紫外光 。因此 受到更强的高光胁迫可能是由于其钙质外壳较薄相较于 不能阻挡更多的可见光所导致的。低 （）条件下，经过短期高光处理的 和 细胞的最终 和修复比率 损伤比率相似。这结果说明 通过其他的光耗散途径抵消 更厚钙质外壳对高光的遮蔽作用，达到保护细胞的目的。高 （）条件下，的最终 及短期高光处理下的修复速率均显著降低，这说明海水酸化会加剧高光对颗石藻的胁迫作用。植物细胞的光合作用能否正常运行由光系统 蛋白的损伤与修复间的平衡决定 。在高（）条件下，细胞高光胁迫下 的修复速率下降，可能是由于高 （）条件导致细胞消耗更多的能量抵御海水酸化。蛋白修复所能利用
26、的能量减少，及酸化条件下细胞内氢离子浓度升高会直接影响 蛋白修复分子的功能都会导致光系统中的 蛋白修复速率下降。等的研究表明光合色素所吸收的过剩光能也会降低 蛋白的修复速率 。本实验中，高 （）条件下 细胞内叶绿素 及类胡萝卜素含量显著增加，光系统就会吸收更多的光能，导致 蛋白修复速率降低。高 （）条件下，和 烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷 细胞的损伤速率均提高且速率相近，表明酸化条件下 细胞更容易受到高光的胁迫。但 细胞的 修复速率提高，导致 细胞的 修复 损伤速率高于 细胞。高光胁迫下酸化条件中的 细胞的最终 高于 ，表明酸化对钙质外壳的影响会导致颗 石 藻 细 胞 更 容 易 受
27、 到 高 光 的 胁 迫。与 低（）适应相比，高 （）适应下 细胞在短期高光胁迫下的最终 显著降低，表明海洋酸化会通过影响颗石藻钙化作用增强高光的胁迫作用。这可能是由于缺乏颗石粒提供的稳定微环境，钙化水平会影响海洋生物对海洋酸化的生理反应 。结论综上所述，属于 进化枝的 的比生长速率较高，而 进化枝的 钙化水平较高。在海洋酸化条件中 会消耗更多的能量用于增殖，而 会增强钙化作用来适应环境变化，反映出两者不同的生存策略。与低 （）适应相比，高 （）适应下最终 、修复速率降低及损伤速率升高均表明酸化条件会增强高光对颗石藻的胁迫作用，而两者的应对策略也有所不同：通过增加 来应对，而高钙化作用的 则依
28、靠更厚钙质外壳对高光的遮蔽作用。参考文献：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：蔡小霞，潘建明，张海娜，等 加富对颗石藻 生长及钙化作用的影响 海洋环境科学，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：第 期林燕妮，等：不同基因型颗石藻（）对海洋酸化及高光耦合的生理响应 ，（）：，：，：，（）：，（）：，?：，（）：，：，：，（）：，?，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，?：，（）：，：，（）：，（）：，（，；，；，；，）（下转第 页）第 期王岩，等：一种改进的 红外舰船目标检测算法的绝缘子缺陷辨识研究 电机与控制学报，（）：，（，）：，：；（责任编辑苏晓东）（上接第 页）：，（）（），（），：；（责任编辑周雪莹）
