1、第 43 卷第 4 期2023 年 8 月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol.43 No.4Aug.2023 收稿日期:2022-04-22 基金项目:“十三五”国家重点研发计划(2016YFD0600801)作者简介:刘亚倩(1996),女,河北张家口人,硕士生,主要从事林源活性成分提取和检测研究 通讯作者:王 进,研究员,博士,主要从事植物化学研究;E-mail:wangjin 。doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2023.04.009低共熔溶剂-球磨法提取竹叶黄酮碳苷工艺优化LIU Y
2、aqian刘亚倩,王 进,汤 锋(国际竹藤中心;国家林业和草原局/北京市共建竹藤科学与技术重点实验室,北京 100102)摘 要:以低共熔溶剂为提取溶剂,用球磨法从毛竹叶中提取黄酮碳苷类化合物,采用高效液相色谱-飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)测定竹叶中 4 种黄酮碳苷(异荭草苷、荭草苷、异牡荆苷和牡荆苷)的含量,通过单因素试验和正交试验,对低共熔溶剂的含水量、提取时间、液料比等因素进行考察。结果表明,从竹叶中提取黄酮碳苷的最佳工艺为:低共熔溶剂(氯化胆碱和乙二醇构成)含水量 50%、提取时间 150 s、液料比 61(mLg)。在该条件下,从竹叶中提取 4 种黄酮碳苷的总提取得率为 1
3、.55 mg/g,其中,异荭草苷 0.99 mg/g、荭草苷0.23 mg/g、牡荆苷0.04 mg/g、异牡荆苷0.29 mg/g。该方法提取得率比浸渍提取法提高了 7.6%,且节约了时间和有机溶剂。利用该优化工艺,结合 LC-Q-TOF-MS 检测,成功应用于以毛竹叶为原料制成竹茶样品的黄酮碳苷提取与测定。关键词:黄酮碳苷;球磨法;低共熔溶剂;提取;竹叶中图分类号:TQ35;R284.2 文献标志码:A 文章编号:0253-2417(2023)04-0060-07引文格式:刘亚倩,王进,汤锋.低共熔溶剂-球磨法提取竹叶黄酮碳苷工艺优化J.林产化学与工业,2023,43(4):60-66.O
4、ptimization of Extraction Process of Flavone C-glycosides from BambooLeaves by Deep Eutectic Solvent-Ball Mill MethodLIU Yaqian,WANG Jin,TANG Feng(International Centre for Bamboo and Rattan;Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration/Beijing forBamboo&Rattan Science and Technolo
5、gy,Beijing 100102,China)Abstract:Ball mill method was used to extract flavone C-glycosides from bamboo leaves using deep eutectic solvents(DESs)asextraction solvent.The contents of four flavone C-glycosides(isoorientin,orientin,isovitexin and vitexin)in bamboo leaves weredetermined by liquid chromat
6、ography quadrupole time-of-flight mass spectrometry(LC-Q-TOF-MS).By single factor experimentsand orthogonal design,the parameters including water content,extraction time and liquid-solid ratio of DESs were investigated.The results showed that the optimized extraction process of flavone C-glycosides
7、from bamboo leaves was as follows:DESs(composed of choline chloride and ethylene glycol)water content of 50%,extraction time of 150 s,and liquid-solid ratio of 61(mLg).Under these conditions,the total extraction yield of four flavone C-glycosides from bamboo leaves was 1.55 mg/g,including isoorienti
8、n of 0.99 mg/g,orientin of 0.23 mg/g,vitexin of 0.04 mg/g and isovitexin of 0.29 mg/g.The extractionyield of this method was 7.6%higher than that of immersion extraction,and the time and organic solvent were saved.Thisoptimized technology combined with LC-Q-TOF-MS detection was successfully applied
9、to the extraction and determination offlavone C-glycosides in bamboo tea samples made from bamboo leaves.Key word:flavone C-glycosides;ball mill;deep eutectic solvents;extraction;bamboo leaves竹叶在我国有着悠久的食用和药用历史。竹叶提取物具有多种生物活性,如抗氧化1-2、抗炎3等。竹叶含有丰富的黄酮成分,竹叶黄酮已于 2004 年作为天然抗氧化剂列入国家标准(GB 27602014),其中竹叶中的 4 种
10、黄酮碳苷(异荭草苷、荭草苷、异牡荆苷和牡荆苷)被认为是天然抗氧化剂的第 4 期刘亚倩,等:低共熔溶剂-球磨法提取竹叶黄酮碳苷工艺优化61 功能成分4。竹叶中黄酮碳苷的提取常用乙醇、甲醇等有机溶剂,且存在溶剂用量大,污染环境等问题5,因此,建立一种简便、绿色的提取方法十分必要。球磨法(BM)是利用机械力使样品达到超微粉碎,促进有效成分从样品中释放6。基于球磨法辅助可形成多种提取方法,如机械化学法(MCE),是指样品超微粉碎后,与周围固体或液体发生化学变化,实现目标成分的高效提取。据报道,从植物玫瑰茄中提取芦丁成分,采用机械化学法优于热回流等传统方法7。在茶多酚的提取中,机械化学法比超声波提取法和
11、微波提取法有更高的提取率8。在可供选择的绿色溶剂中,低共熔溶剂(DES)是一种新型绿色溶剂,表现出与离子液体相似的性能,它由氢键供体与氢键受体混合得到熔点更低的溶剂,与传统溶剂相比,具有不易挥发、无毒和生物相容性好等特点9-10。低共熔溶剂的溶解能力强,溶解范围广,可以选择不同的氢键供体与氢键受体来增加对目标化合物的溶解度,已在天然产物提取方面得到广泛应用11-12。目前,通过结合低共熔绿色溶剂和球磨法的优势,实现了青蒿素13、茶多酚14和丹参酮15等天然产物成分的高效提取。本研究建立了一种基于低共熔溶剂-球磨法提取竹叶中黄酮碳苷(异荭草苷、荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷)的方法,采用高效液相色谱-
12、飞行时间质谱进行定性和定量分析,以期为竹叶黄酮碳苷的研究提供一种新的绿色提取分析策略。1 实 验1.1 材料、试剂与仪器毛竹叶于2020 年8 月采自江西井冈山,竹叶样品于室温下晾干,所采集的竹种经国际竹藤中心高志民研究员鉴定为毛竹(Phyllostachys edulis(Carr.)J.Houz.)。竹茶样品由井冈山桦林生物有限公司提供,是以江西井冈山的毛竹叶为原料,经挑选、清洗、干燥等工序制成的代用茶。供试样品粉碎后过筛,取粒径380 m 的部分备用。乙腈,色谱纯;无水乙醇、乙二醇,市售分析纯;氯化胆碱(纯度 98%)、1,4-丁二醇(纯度98%),上海麦克林生化科技有限公司;尿素,安徽
13、酷尔生物工程有限公司;无水柠檬酸,源叶生物科技有限公司;异荭草苷、荭草苷、异牡荆苷和牡荆苷标准品(纯度98%),上海安谱实验科技股份有限公司。IKA Vortex 4 涡旋混匀器,上海泰坦科技股份有限公司;Thermo Fresco21 离心机,美国赛默飞世尔科技有限公司;高效液相色谱-飞行时间质谱,Agilent 1290 型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器和6540 型飞行时间质谱,美国 Agilent 公司;JXFSTPRP-24 全自动样品快速研磨仪,上海净信实业发展有限公司。1.2 低共熔溶剂的制备不同物质的量比的氢键供体(HBD)和氢键受体(HBA)混合后在 80 用玻璃棒搅拌制
14、成均一、透明的液体,即为低共熔溶剂,见表 1。在制备好的低共熔溶剂中再加入不同体积的水,获得不同含水量的低共熔溶剂。表 1 低共熔溶剂制备Table 1 Preparation of deep eutectic solvents(DESs)低共熔溶剂deep eutectic solvents(DESs)氢键受体hydrogen bond acceptor(HBA)氢键供体hydrogen bond donor(HBD)氢键受体/氢键供体物质的量比molar ratio of HBA/HBDDES-1氯化胆碱 choline chloride乙二醇 ethylene glycol12DES-2
15、氯化胆碱 choline chloride1,4-丁二醇 1,4-butane-diol14DES-3氯化胆碱 choline chloride尿素 carbamide12DES-4氯化胆碱 choline chloride柠檬酸 citric acid111.3 竹叶黄酮碳苷的提取1.3.1 低共熔溶剂-球磨法提取竹叶黄酮碳苷1.3.1.1 单因素试验 准确称取竹叶粉末 100 mg 于 2 mL 离心管中,加入低共熔溶剂和研磨珠(氧化锆材质),利用全自动样品快速研磨仪,在研磨频率 60 Hz 的条件下球磨法提取,研磨时间即为提取时62 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷间,提取后置于离
16、心机中,在 9 000 r/min 条件下离心 5 min,然后取适量上清液加入无水乙醇定容,取1 mL提取液过 0.22 m 滤膜,进高效液相色谱-飞行时间质谱测定,考察提取时间、液料比(mLg,提取溶剂的体积与样品质量比)和低共熔溶剂含水量对竹叶中 4 种黄酮碳苷提取得率的影响。1.3.1.2 正交试验 根据单因素试验结果,选取低共熔溶剂含水量(体积分数)为 40%、50%和 60%,提取时间为 120、150 和 180 s 和液料比为 61(mLg,下同)、71 和 81,进行 L9(34)正交试验。1.3.2 不同提取方法的比较 比较低共熔溶剂-球磨法提取与 2 种常规提取方法(超声
17、波提取16和浸渍提取17)对竹叶黄酮碳苷的提取效果,其中,超声波提取法的提取条件为:提取溶剂 60%甲醇(体积分数),液料比 151,提取时间 1.5 h。浸渍提取法的提取条件为:提取溶剂 80%乙醇(体积分数),液料比 501,提取时间 48 h。1.4 竹叶黄酮碳苷的定量与定性分析1.4.1 高效液相色谱法定量 采用高效液相色谱法测定4 种黄酮碳苷15,色谱条件为:色谱柱 Eclipseplus C18(2.1 mm 150 mm,1.8 m),前置预柱 C18(2.1 mm 5 mm,2.7 m);柱温 40;以体积比1585的乙腈-水(含体积分数为 0.1%的甲酸)为流动相,流速 0.
18、25 mL/min,进样量 2 L;利用光电二极管阵列检测器对 4 种黄酮碳苷进行全波长扫描,检测波长选为 345 nm。准确称取异荭草苷(6.3 mg)、荭草苷(4.4 mg)、牡荆苷(5.3 mg)和异牡荆苷(4.1 mg)4 种标准品,分别溶于甲醇,制成标准储备液。分别取标准储备液于 10 mL 容量瓶中,以甲醇定容,使 4 种标准品的质量浓度均为 80 mg/L,通过倍半稀释法,制备出含有 4 种标准品且质量浓度均为 80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04 和0.02 mg/L 的混合标准溶液,于4 冰箱备用。根据混合标准溶液建立
19、标准曲线,通过系列混合标准溶液的进样,分别以 4 种黄酮碳苷的质量浓度为横坐标(x,mg/L)、色谱峰面积为纵坐标(y),进行线性方程拟合,最终在0.16 80 mg/L 的质量浓度范围内,分别建立了标准曲线方程,异荭草苷:y=23.625 4x+0.770 6;荭草苷:y=26.348 4x+0.132 1;牡荆苷:y=15.761 9x+19.773 3;异牡荆苷:y=26.908 5x+4.098 9,标准曲线的线性关系均良好(R20.999)。基于标准曲线方程计算出竹叶黄酮碳苷的质量,按下式计算 4 种黄酮碳苷总得率。Y=mm0(1)式中:Y4 种黄酮碳苷总得率,mg/g;m0供试样品
20、总质量,g;m提取并测定的 4 种黄酮碳苷质量之和,mg。当式中 m 仅为某一种黄酮碳苷的质量时,则计算结果为该单一黄酮碳苷的提取得率。1.4.2 飞行时间质谱定性 采用飞行时间质谱结合标准品对竹叶提取液中的 4 种黄酮碳苷进行定性分析。质谱条件:在正离子模式下 m/z 采集范围50 1 000,离子源的干燥气体温度300,干燥气体流速 7 L/min,鞘气流速 11 L/min,鞘气温度 350,雾化器压力 35 psi,喷雾电压 4 kV,喷嘴电压 1 kV。质谱数据分析使用 MassHunter B.04.00 软件(美国安捷伦公司)。差异显著性用 SPSS 软件的方差分析(ANOVA)
21、和邓肯检验(Duncan),其中 p=0.05。2 结果与讨论2.1 样品中黄酮碳苷的 LC-Q-TOF-MS 分析以竹叶为原料,氯化胆碱与乙二醇制备的低共熔溶剂(DES-1)为提取溶剂,DES-1 含水量 50%,提取时间150 s,液料比61(mLg),进行低共熔溶剂-球磨法提取,利用 LC-Q-TOF-MS 技术,通过优化色谱条件,4 种黄酮碳苷标准品和竹叶提取物的液相色谱图,见图 1。从图 1(a)看出,4 种黄酮碳苷的色谱峰能够达到良好的色谱分离,且 4 种黄酮碳苷的保留时间均在 10 min 以内。从图1(b)可知,在竹叶提取物中存在4 个色谱峰(标为1、2、3 和4),与4 种黄
22、酮碳苷标准品的保留时间一致,且没有明显的干扰峰,说明该方法适合于竹叶中 4 种黄酮碳苷的定量检测。第 4 期刘亚倩,等:低共熔溶剂-球磨法提取竹叶黄酮碳苷工艺优化63 1.异荭草苷 isoorientin;2.荭草苷 orientin;3.牡荆苷 vitexin;4.异牡荆苷 isovitexin图 1 黄酮碳苷混合标准溶液(a)和竹叶提取物(b)的液相色谱分析Fig.1 Liquid chromatograms of four flavone C-glycosides standard compounds(a)and bamboo leaves extract(b)利用高分辨质谱对竹叶中 4
23、 种黄酮碳苷色谱峰进行定性分析,将样品的特征离子的精确质量数、同位素峰、保留时间等数据与标准化合物进行比对,进行 4 种黄酮碳苷的定性鉴定,结果见图 2 和表 2。1.异荭草苷 isoorientin;2.荭草苷 orientin;3.牡荆苷 vitexin;4.异牡荆苷 isovitexin图 2 黄酮碳苷标准溶液(a)和竹叶提取物(b)的质谱基峰Fig.2 Base peak chromatograms of four flavone C-glycosides standard compounds(a)and bamboo leaves extract(b)从图2 看出,竹叶提取物中保留时
24、间在5 10 min 内出现的4 个质谱峰与标准品中4 种黄酮碳苷的保留时间一致。在表 2 中列出了竹叶提取物中 4 个质谱峰的准分子离子峰、精确相对分子质量和分子式等信息,验证了竹叶提取物中 4 种黄酮碳苷分别为异荭草苷、荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷。表 2 竹叶提取物中 4 种黄酮碳苷的质谱鉴定Table 2 MS data of the four flavone C-glycosides from bamboo leaves extract by LC-Q-TOF-MS序号No.保留时间/minretention time准分子离子峰M+H+误差error精确相对分子质量accurate r
25、elative molecular mass分子式molecular formula鉴定identification15.34449.107 02.25448.100 6C21H20O11异荭草苷 isoorientin26.19449.106 73.44448.100 6C21H20O11荭草苷 orientin39.03433.112 02.97432.105 6C21H20O10牡荆苷 vitexin49.39433.112 41.83432.105 6C21H20O10异牡荆苷 isovitexin2.2 提取工艺优化2.2.1 低共熔溶剂的筛选 低共熔溶剂的黏度、极性等理化性质,会对
26、目标物的提取产生影响。根据文献18,在 30 条件下,供试 4 种低共熔溶剂的黏度从小到大依次为:DES-1(0.025 Pas)、DES-2(0.047 Pa s)、DES-3(0.214 Pa s)、DES-4(45.008 Pa s),其中,氯化胆碱和柠檬酸构成的低共熔溶剂(DES-4)黏度最大,由于其流动性差,无法直接用于样品提取。因此,为比较不同低共熔溶剂对黄酮碳苷的提取效果,在 4 种低共熔溶剂中均加入水混合均匀,使其含水量为 50%,以降低溶剂的黏度,提高极性,4 种低共熔溶剂(DES-1、DES-2、DES-3 和 DES-4)对竹叶黄酮碳苷的提取总得率分别为(1.50 0.0
27、8)、(1.43 0.08)、(1.20 0.06)和(1.16 0.05)mg/g。不同低共熔熔溶剂对供试的 4 种黄酮碳苷的提取结果存在显著差异,其中,以氯化胆碱和乙二醇所构成的 DES-1 提取得率最高,达 1.50 mg/g,这可能是因为 DES-1 具有黏度低、易扩散等特质,使其对竹叶细胞有较好的渗透性。为进一步优化提64 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷取条件,选择 DES-1 为提取溶剂,对低共熔溶剂的含水量、液料比和提取时间等因素进行研究。2.2.2 单因素试验2.2.2.1 低共熔溶剂含水量 选择 DES-1 为提取溶剂,在液料比 101、提取时间 120 s 的条件下
28、,比较不同含水量的 DES-1 对竹叶中 4 种黄酮碳苷的提取效果,见图 3(a)。由图 3(a)可知,DES-1 含水量在 20%50%范围内,黄酮碳苷的总提取得率随着 DES-1 含水量的升高呈递增趋势,其原因可能是含水量的增加提高了低共熔溶剂的极性,降低了黏度,提高了 DES-1 对目标化合物的溶解力。当 DES-1 含水量为 50%60%时,黄酮碳苷的总提取得率出现了下降,说明DES-1 对目标物的溶解力达到了峰值后不再增加,可能由于水易形成氢键,当低共熔溶剂中含水量增加到一定程度,会影响低共熔溶剂自身的氢键结构,导致提取效果下降。2.2.2.2 提取时间 选择 DES-1 含水量50
29、%,在液料比101 的条件下,比较不同研磨提取时间对4 种黄酮碳苷提取结果,见图 3(b)。由图可知,竹叶黄酮碳苷的总提取得率受提取时间的影响较大,提取时间由 30 s 上升到 120 s,竹叶黄酮碳苷总提取得率呈增加趋势,之后保持平稳。2.2.2.3 液料比 当 DES-1 含水量为 50%,提取时间为 120 s 时,不同液料比对黄酮碳苷的提取结果见图 3(c)。随着液料比值的增加,竹叶黄酮碳苷的总提取得率先表现出增高趋势,当液料比大于 8 1时,总提取得率呈现出下降趋势,可能由于溶剂量的增加增加了样品研磨的阻力,不利于植物细胞的研磨破碎,造成了总提取得率下降。a.含水量 water co
30、ntent;b.提取时间 extraction time;c.液料比值 liquid-solid ratio图 3 不同提取条件对 4 种竹叶黄酮碳苷总提取得率的影响Fig.3 Effect of different conditions on total extraction yield of four flavone C-glycosides from bamboo leaves2.2.3 正交试验 采用正交试验考察 DES-1 含水量、提取时间和液料比3 个因素对竹叶黄酮碳苷提取得率的影响,结果见表 3。表 3 正交试验Table 3 Orthogonal test编号No.ADES-1
31、 含水量/%water content of DES-1B提取时间/sextraction timeC液料比(mLg)liquid-to-solid ratio4 种黄酮碳苷总得率/(mg g-1)total yield of four flavoneC-glycosides140120611.51240150711.52340180811.13450120711.49550150811.51650180611.55760120811.49860150611.52960180711.52k11.391.501.53k21.521.521.51k31.511.401.38R0.130.120.1
32、5第 4 期刘亚倩,等:低共熔溶剂-球磨法提取竹叶黄酮碳苷工艺优化65 根据极差(R)分析,3 个因素对供试黄酮碳苷总得率的影响顺序为液料比 DES-1 含水量 提取时间。根据方差分析结果(表4)3 个因素对4 种黄酮碳苷提取得率均无显著性影响。根据 k 值结果,正交试验提取工艺的最优组合是 A2B2C1,即 DES-1 含水量 50%、提取时间 150 s、液料比 61(mLg)。表 4 正交试验方差分析结果Table 4 Analysis of variance of orthogonal test方差来源source离差平方和sum of squares自由度df均方mean squar
33、eF 值F value显著性significantA0.03220.0160.859p 0.05B0.02320.0120.642p 0.05C0.04120.0201.084p 0.05F0.05(2,2)=19.00 对最佳工艺进行验证试验,分别以竹叶、竹茶为供试样品,利用最佳工艺方法,重复实验3 次,结果表明,竹叶提取物中4 种黄酮碳苷总得率为1.55 mg/g,其中,异荭草苷、荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷提取得率分别为(0.99 0.01)、(0.23 0.04)、(0.04 0.01)和(0.29 0.04)mg/g。竹茶中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷提取得率分别为(0.92 0.
34、05)、(0.24 0.03)、(0.12 0.03)和(0.27 0.02)mg/g,说明竹叶加工成竹茶后,其中的竹叶黄酮碳苷没有明显损失,有利于人们从竹茶中摄取植物黄酮。2.2.4 提取方法比较 比较 2 种常用提取方法16-17与低共熔溶剂-球磨法的提取效果,以 4 种黄酮碳苷总得率为指标,结果见表 5。表 5 不同提取方法比较Table 5 Comparison of different extraction methods提取方法extraction method提取溶剂extraction solvent提取时间extraction time4 种黄酮碳苷总得率1)/(mg g-1
35、)total yield of four flavone C-glycosides文献ref.低共熔溶剂-球磨法ball mill assisted deep eutecticsolvent extractionn(氯化胆碱)/n(乙二醇)(12)n(choline chloride)/n(ethylene glycol)2.5 min1.55 0.03 a本研究this study超声波提取ultrasonic extractionV(甲醇)/V(水)(64)V(methanol)/V(water)90 min1.60 0.04 a16浸渍提取soaking method extractio
36、nV(乙醇)/V(水)(82)V(ethanol)/V(water)48 h1.44 0.01 b171)同列不同字母表示差异显著 different letters in the same column indicated significant difference(p 0.05)根据表 5 可知,低共熔溶剂-球磨法、超声波提取法和浸渍提取法从竹叶中提取 4 种黄酮碳苷的总得率分别为 1.55、1.60 和 1.44 mg/g,差异显著性分析显示,低共熔溶剂-球磨法与超声波提取法无显著性差异,低共熔溶剂-球磨法与浸渍提取法提取得率差异显著且比浸渍提取法得率提高了 7.6%,且优化的低共熔溶
37、剂-球磨法提取时间 2.5 min,而超声波提取时间为 90 min,因此,优化建立的低共熔溶剂-球磨法在竹叶黄酮碳苷的提取中具有操作时间短、环境污染小等优势,适合于竹叶黄酮碳苷的提取。3 结 论建立了优于传统浸渍提取法的低共熔溶剂-球磨法,其提取竹叶中 4 种黄酮碳苷的最佳工艺条件为:DES-1 含水量 50%、提取时间 150 s、液料比 61(mLg),在此条件下测得毛竹叶提取物中 4 种黄酮碳苷的总得率为 1.55 mg/g。利用低共熔溶剂-球磨法提取,结合 LC-Q-TOF-MS 分析,成功从竹叶和竹茶中提取、测定了 4 种黄酮碳苷(异荭草苷、荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷)。该方法简单高
38、效,在缩短样品制备时间,使用环保溶剂等方面比传统提取方法有了改进。参考文献:1 HU Y,ZHAO G,YIN F,et al.Effects of roasting temperature and time on aldehyde formation derived from lipid oxidation in scallop66 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷(Patinopecten yessoensis)and the deterrent effect by antioxidants of bamboo leavesJ/OL.Food Chemistry,2022,369:1
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